TCVMA 12-2018 猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR检测方法

ICS11.220B41MA团体标准T/CVMA12—2018猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR检测方法Real-TimeRT-PCRfordetectionofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus2018-10-24发布2018-10-24实施中国兽医协会发布T/CVMA12—2018I前言本标准按GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中国兽医协会提出并归口。本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：周智、王传彬、杨林、吴佳俊、宋晓晖、翟新验、倪建强、刘玉良、张硕、刘颖昳、赵柏林、顾小雪、曲萍。T/CVMA12—20181猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR检测方法1范围本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR诊断技术、鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR诊断技术。本标准主要用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T25172猪常温精液生产与保育技术规范NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范执行3试剂与耗材3.1RNA提取试剂RNA提取试剂详见附录A，或选取商品化的病毒RNA提取试剂盒。3.2其他试剂TaqDNA聚合酶（5U/µL），PrimeScriptTMRTMixⅡ反转录酶混合物，50×ROXReferenceDyeⅡ,2×OneStepRT-PCRBufferⅢ缓冲液，无水乙醇，无菌无核酸酶水，生理盐水。3.3引物探针3.3.1猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR引物和探针，见表1。表1猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR引物和探针序列名称序列（5＇-3＇）美洲型上游引物（NAF）TGGARATTCATCACCTCCAGR美洲型下游引物（NAR）GTGCCGTTRACCGTAGTGGA欧洲型上游引物（EUF）ACTTCCAGATGCAGATTGTGT欧洲型下游引物（EUR）GCCGTTCACTGATGTTAGTCC探针FAM-TACATTCTGGCCCCTGCCCAYCA-BHQ注：将表中引物和探针用无菌无核酸酶水稀释至10pmol/µL后使用。3.3.2美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒双重实时荧光RT-PCR引物和探针,见表2。表2美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒双重实时荧光RT-PCR引物和探针序列T/CVMA12—20182名称序列（5＇-3＇）美洲型和欧洲型上游引物（NAF-EUF）CGCCAGCCAGTCAATCARC美洲型和欧洲型下游引物（NAR-EUR）GRGGAAAATGKGGCTTCTCMG欧洲型探针FAM-TCCTCCCCTRGGTTGCTGGCGCT-BHQ美洲型探针HEX-YCCCGGTCCCTTGCCTCTGGA-BHQ注：将表中引物和探针用无核酸酶的灭菌蒸馏水稀释至10pmol/µL后使用。4仪器与设备分析天平、高速离心机、荧光PCR仪、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器。5操作步骤5.1样品采集5.1.1组织样品采集组织样品采集按照NY/T541进行。取病死猪肺脏、淋巴结、扁桃体等组织；待检活猪，采集血液3mL～5mL，也可采取扁桃体样品。5.1.2公猪精液采集公猪精液采集按照GB/T25172的方法进行。5.2样品的处理5.2.1组织样品处理每份组织分别从三个不同的典型病变位置处称取样品约1g，剪碎混匀后取0.02g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至灭菌离心管中，6000×g离心2min，吸取上清液到新的离心管备用。5.2.2血液样品处理将采集的血液室温或者37℃倾斜放置，待血清析出后吸取上清液到新的离心管备用。5.2.3精液样品处理精液样品无需处理，直接用于核酸提取。5.2.4阳性对照样品处理取美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性组织研磨上清液各100µL(病毒含量105.0TCID50/mL)，用于病毒RNA提取。5.2.5阴性对照样品处理取猪繁殖与呼吸综合征病毒阴性组织研磨上清液100µL，用于病毒RNA提取。5.3病毒RNA提取T/CVMA12—201835.3.1若选用附录A中所列试剂提取病毒RNA，则参照以下步骤进行操作：a)取已处理的样品、阴性对照和阳性对照各100µL，分别加入裂解液600µL，充分颠倒混匀，室温静置3min～5min。b)将液体吸入吸附柱中，10000×g离心30s。c)弃去收集管中液体，加入600µL洗涤液，10000g离心30s。d)重复步骤c)。e)弃去收集管中液体，10000×g离心2min，以除去残留的洗涤液。f)将吸附柱移入新的离心管中，向柱中央加入洗脱液50µL，室温静置1min，10000×g离心30s，离心管中液体即为模板RNA。5.3.2若使用病毒RNA试剂盒提取病毒RNA，则按试剂盒说明书进行操作。5.4实时荧光RT-PCR扩增方法5.4.1按照表3配制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR扩增反应体系。表3猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR扩增反应体系试剂体积无菌无核酸酶水4.3µL美洲型上游引物（10pmol/µL）0.9µL美洲型下游引物（10pmol/µL）0.9µL欧洲型上游引物（10pmol/µL）0.9µL欧洲型下游引物（10pmol/µL）0.9µL探针（10pmol/µL）0.6µL2×OneStepRT-PCRBufferIII缓冲液12.5µLTaqDNA聚合酶(5µL)0.5µLPrimeScriptTMRTEnzymeMixⅡ0.5µL50×ROXReferenceDyeⅡ0.5µLRNA模板2.5µL总体积25.0µL将表3中所有试剂加入荧光RT-PCR反应管后，充分混匀，做好标记。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR扩增所用荧光报告基团为FAM，淬灭基团为BHQ或None。在荧光PCR仪上按表4所示程序进行扩增反应。表4猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR扩增程序步骤温度持续时间循环数142℃5min1295℃10s1395℃5s40460℃35s注：在每个循环第二步（60℃35s）收集荧光信号。5.4.2按照表5配制鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR扩增反应体系。表5鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR扩增反应体系T/CVMA12—20184试剂体积无菌无核酸酶水5.5µL美洲型探针（10pmol/µL）0.5µL欧洲型探针（10pmol/µL）0.5µL美洲型和欧洲型上游引物（NAF-EUF）（10pmol/µL）1µL美洲型和欧洲型下游引物（NAR-EUR）（10pmol/µL）1µL2×OneStepRT-PCRBufferIII缓冲液12.5µLTaqDNA聚合酶(5µL)0.5µLPrimeScriptTMRTEnzymeMixⅡ0.5µL50×ROXReferenceDyeⅡ0.5µLRNA模板2.5µL总体积25.0µL将表5中所有试剂加入荧光RT-PCR反应管后，充分混匀，做好标记。扩增欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光报告基团为FAM，扩增美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光报告基团为HEX，淬灭基团均为BHQ或None（如果仪器未经HEX校正过，可用VIC代替）。在荧光PCR仪上按表6所示程序进行扩增反应。表6鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR扩增程序步骤温度持续时间循环数142℃5min1295℃10s1395℃5s40460℃35s注：在每个循环第二步（60℃35s）收集荧光信号。6结果判定6.1阈值设定阈值线设定于阴性对照扩增曲线的最高点。6.2结果判定6.2.1通用型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR结果判定6.2.1.1美洲型或欧洲型阳性对照Ct值≤30并出现特定的扩增曲线，阴性对照无Ct值并且无特定扩增曲线，实验结果成立，否则实验结果不成立，实例可参考附录B.1。6.2.1.2被检样品FAM荧光信号Ct值≤30并出现特定的扩增曲线为PRRSV阳性。6.2.1.3被检样品30＜Ct值＜37并出现特定的扩增曲线，需重新取样提取RNA，扩增后结果判定仍是可疑的，可判定为阳性。6.2.1.4被检样品Ct值≥37时，判定为阴性。6.2.1.5对于某些未呈现S型曲线，但本底较高的样品，应判定为阴性。6.2.2鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征实时荧光RT-PCR结果判定T/CVMA12—201856.2.2.1美洲型和欧洲型阳性对照Ct值≤30并出现特定的扩增曲线，阴性对照无Ct值并且无特定扩增曲线，实验结果成立，否则实验结果不成立，实例可参考附录B.2。6.2.2.2被检样品若FAM荧光信号Ct值≤30并出现特定的扩增曲线为欧洲型PRRSV阳性；被检样品若Hex荧光信号Ct值≤30并出现特定的扩增曲线为美洲型PRRSV阳性。6.2.2.3被检样品30＜Ct值＜35并出现特定的扩增曲线，需重新取样提取RNA，扩增后结果判定仍是可疑的，可判定为阳性。6.2.2.4被检样品Ct值≥35时，判定为阴性。6.2.2.5对于某些未呈现S型曲线，但本底较高的样品，应判定为阴性。T/CVMA12—20186AA附录A（规范性附录）RNA提取液的配制A.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液（pH值8.0）EDTA18.61g灭菌纯化水80mL氢氧化钠调pH至8.0灭菌纯化水加至100mLA.2裂解液异硫氰酸胍236.4g氯化钠23.2g0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH值8.0）40mL灭菌双蒸水加至2000mLA.3洗涤液磷酸氢二钠143.2g磷酸二氢钾62.4g氯化钠18g无水乙醇6000mL灭菌双蒸水加至8000mLA.4洗脱液磷酸氢二钠143.2g，磷酸二氢钾62.4g灭菌双蒸水加至2000mLA.5吸附柱和收集管吸附柱的离心柱层析膜材质为硅基质膜，厚度0.28cm；吸附柱的装量为800μL/个。T/CVMA12—20187BB附录B（资料性附录）实时荧光RT-PCR扩增实例参照B.1通用型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR扩增实例参照B.2鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒双重实时荧光RT-PCR扩增实例参照_________________________________