TGZTPA 0002-2019 蔬菜及水果中毒死蜱残留的测定 酶联免疫吸附法

1T/GZTPA团体标准T/GZTPA0002-2019蔬菜及水果中毒死蜱残留的测定酶联免疫吸附法Determinationofclorpyrifosresiduesinvegetablesandfruits—Enzymelinkedimmunosorbentassay2019-12-12发布2020-02-01实施贵州省绿茶品牌发展促进会发布T/GZTPA0002-2019I目次前言..................................................................................................................................................Ⅱ1范围................................................................................................................................................12规范性引用文件...........................................................................................................................13原理................................................................................................................................................14试剂和材料...................................................................................................................................15仪器................................................................................................................................................26试样制备与保存...........................................................................................................................27试样测定........................................................................................................................................28结果计算........................................................................................................................................39检测限、准确度和精密度...........................................................................................................3T/GZTPA0002-2019II前言本标准按照GB/T1.1－2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则和国家茶叶标准的相关规定而起草。本标准由贵州省绿茶品牌发展促进会提出并归口。本标准主要起草单位：贵州省绿茶品牌发展促进会、贵州勤邦食品安全科学技术有限公司。本标准主要起草人:谢体波、雷雨田、胡鹏、张凯、陈鑫、杨玉洁。T/GZTPA0002-20191蔬菜及水果中毒死蜱残留的测定酶联免疫吸附法1范围本标准规定了蔬菜及水果中毒死蜱残留量的酶联免疫吸附测定法。本标准适用于蔬菜及水果中毒死蜱残留量的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理采用间接竞争酶联免疫吸附（ELISA）方法，在微孔条上包被偶联抗原，试样中残留的毒死蜱与酶标板上的偶联抗原竞争毒死蜱抗体，加入酶标记的抗体后，显色剂显色，终止液终止反应。用酶标仪在450nm处测定吸光度，吸光值与毒死蜱残留量呈负相关，与标准曲线比较，再乘以其对应的稀释倍数，即可得出毒死蜱残留含量。4试剂和材料4.1毒死蜱试剂盒4.1.196孔板（12条×8孔）包被有毒死蜱偶联抗原。4.1.2毒死蜱标准溶液（至少有5个倍比稀释浓度水平，外加1个空白）。4.1.3毒死蜱抗体溶液。4.1.4过氧化物酶标记物。4.1.5底物显色溶液A液：过氧化尿素。4.1.6底物显色溶液B液：四甲基联苯胺。4.1.7反应终止液：1mol/L硫酸。4.1.8复溶液（2倍浓缩液）。4.1.9洗涤液（20倍浓缩液）。4.2乙醇（分析纯）4.3水：GB/T6682规定的一级水。T/GZTPA0002-201924.4复溶液工作液：用水将2倍的浓缩复溶液按1∶1体积比进行稀释（1份2倍浓缩复溶液＋1份水），用于试样的稀释，复溶液工作液在4℃可保存一个月。4.5洗涤液工作液：用水将20倍的浓缩洗涤液按1∶19体积比进行稀释（1份20倍浓缩洗涤液＋19份水），用于酶标板的洗涤，洗涤液工作液在4℃可保存一个月。5仪器5.1酶标仪：配备450nm滤光片。5.2均质器。5.3天平：感量0.01g。5.4涡旋仪。5.5离心机：转速≥3000r/min。5.6恒温箱。5.7微量移液器：单道20μL～200μL、100μL～1000μL可调，多道250μL。6试样制备与保存取蔬菜及水果样品，剪碎，10000r/min均质1min。制备好的试样，应即刻进行提取和检测。7试样测定7.1提取称取蔬菜、水果试样1.0g±0.05g于50mL聚苯乙烯离心管中，加10mL乙醇，涡动2min，3000r/min以上，20～25℃离心5min，取上层清液100μL至2mL聚苯乙烯离心管中，加入900μL复溶液工作液，涡动20s，充分混匀，取50μL用于分析。7.2测定使用前将试剂盒在20～25℃下放置1～2h。7.2.1将标准和试样（至少按双平行实验计算）所有数量的孔条插入微孔架，记录标准和试样的位置。7.2.2加50μL系列标准溶液（4.1.2）或处理好的试样溶液到各自的微孔中。标准和试样至少做两个平行试验。7.2.3加毒死蜱抗体溶液（4.1.3）50μL到每一个微孔中，充分混合，于25℃恒温箱中孵育30min。7.2.4倒出孔中液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。用250μL洗涤液工作液充入孔中，再次倒掉微孔中的液体，再重复操作两遍以上（或用洗板机洗涤）。7.2.5加100μL过氧化物酶标记物（4.1.4），25℃恒温箱中孵育30min。7.2.6倒出孔中液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。用250μL洗涤液T/GZTPA0002-20193工作液充入孔中，再次倒掉微孔中的液体，再重复操作两遍以上（或用洗板机洗涤）。7.2.7加50μL底物显色溶液A液（4.1.5）和50μL底物显色溶液B液（4.1.6），混合并在25℃恒温箱避光显色15min。7.2.8加50μL反应终止液（4.1.7），轻轻振荡混匀，用酶标仪在450nm处测量吸光度值。8结果计算用所获得的标准溶液和试样溶液吸光度值与空白溶液吸光度值的比值进行计算，见式（1）：%1000rBBA(1)式中：Ar——相对吸光度值，%；B——标准（试样）溶液的吸光度值；B0——空白（浓度为0的标准溶液）的吸光度值。将计算的相对吸光度值（%）对应克百威（μg/L）的自然对数做半对数坐标系统曲线图，对应的试样浓度可从校正曲线算出，见式（2）：1000XmfA(2)式中：X——试样中毒死蜱的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；A——试样中相对吸光度值（%）对应的克百威含量，单位为微克每升（μg/L）；f——试样稀释倍数；m——试样的取样量，单位为克（g）。计算结果表示到小数点后两位。阳性结果应用确证法确证。9检测限、准确度和精密度9.1检测限本标准的方法检测限：毒死蜱在蔬菜和水果中的检测限均为100μg/kg。9.2准确度在试样中添加100μg/kg~2000μg/kg浓度水平的毒死蜱时，回收率为70%~110%。9.3精密度本方法的批内变异系数≤15%，批间变异系数≤20%。