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ICS11.220B41DB37山东省地方标准DB37/T3571—2019牛副结核病γ干扰素ELISA诊断技术Diagnosisonbovineparatuberculosisbyenzyme-linkedimmunoassayofγ-interferon2019-05-29发布2019-06-29实施山东省市场监督管理局发布DB37/T3571—2019I目次前言................................................................................II1范围...............................................................................12规范性引用文件.....................................................................13术语和定义.........................................................................14试验原理...........................................................................15试剂及仪器.........................................................................15.1材料...........................................................................15.2仪器...........................................................................26检测方法...........................................................................26.1试剂配制.......................................................................26.2采血...........................................................................26.3全血培养.......................................................................26.4检测步骤.......................................................................27结果判定...........................................................................27.1样品结果计算...................................................................27.2阴阳性结果判定标准.............................................................38废弃物的处理.......................................................................39检测过程中防止交叉污染的措施.......................................................310操作注意事项......................................................................3附录A（资料性附录）血液处理所需材料............................................4附录B（资料性附录）ELISA试验所需试剂...........................................5附录C（资料性附录）检测所需仪器................................................6附录D（规范性附录）检测所用试剂的配制..........................................7DB37/T3571—2019II前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心。本标准主要起草人：解晓莉、杨宏军、张亮、孙阳阳、程凯慧、楚会萌、刘来兴、杨美。DB37/T3571—20191牛副结核病γ干扰素ELISA诊断技术1范围本标准规定了牛副结核病γ干扰素ELISA诊断技术的术语和定义、试剂及仪器、检测方法、结果判定和操作注意事项等。本标准所规定的技术适用于牛感染副结核分枝杆菌时γ干扰素的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489—2008实验室生物安全通用要求GB/T19495.2—2004转基因产品检测实验室技术要求SN/T1084—2010牛副结核病检疫技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1牛副结核病Paratuberculosis一种由副结核分枝杆菌（禽分枝杆菌副结核亚种）引起的以慢性增生性、顽固性肠炎和进行性消瘦为特征的慢性传染病，具有强烈的传染性，可垂直传播。4试验原理被副结核分枝杆菌致敏的T淋巴细胞再次受到相关抗原刺激后可短时间内释放大量的γ干扰素（γ-Interferon），通过γ干扰素的检测可实现对副结核分枝杆菌感染的诊断。5试剂及仪器5.1材料5.1.1血液处理所需材料血液培养所需材料参见附录A。5.1.2ELISA试验所需试剂ELISA试验所需试剂参见附录B。DB37/T3571—201925.2仪器检测所需仪器参见附录C。6检测方法6.1试剂配制检测所需试剂及制备方法按附录D的规定。6.2采血血液的采集按SN/T1084—2010规定的方法执行。将采集的血液(至少5mL)放入肝素抗凝管中，轻轻颠倒6～10次混合血液，使肝素溶解，室温(22℃±5℃)下运送到实验室并在采血后30h内进行培养。6.3全血培养6.3.1血液分装用一次性自动移液器在无菌条件下将抗凝血加入24孔组织培养板，每份血分三孔，1.5mL/孔。6.3.2加入抗原6.3.2.1无菌操作下分别加入100μLPBS(阴性抗原对照)，禽结核提纯菌素（A-PPD）及牛结核提纯菌素（B-PPD）至相应的孔。6.3.2.2用微量振荡器高速振荡1min，将抗原与分装的血液充分混匀。或将细胞培养板及其盖紧紧固定在一起，在光滑的表面上顺时针和逆时针各旋转10次。6.3.3孵育将组织培养板在37℃恒温培养箱中孵育16h～24h。6.3.4血浆样品收取及贮存用可调移液器小心吸取约400μL的上层血浆，转入新的1.5mL离心管中。吸取血浆时应尽量避免吸入细胞。将盖子密封，表明时间、编号等信息，在2℃～8℃可贮存7天，在-20℃可贮存数月。检测前，样品应恢复至室温并充分混匀。6.4检测步骤6.4.1溶解冻干试剂，按“说明10”平衡其他试剂。6.4.2按照商品化牛IFN-γ检测试剂盒说明书进行牛IFN-γ的ELISA检测。6.4.3质量控制。按照试剂盒质量控制标准判断试验的有效性。如果试验中阴阳性对照结果有一条不符合试验标准，试验则视为无效，应重新检测。7结果判定7.1样品结果计算计算每个样品阴性抗原、A-PPD和B-PPD的平均OD值。DB37/T3571—201937.2阴阳性结果判定标准A-PPD与PBSOD值的差值≥0.35，且与B-PPDOD值的差值≥0.25时，判为阳性；A-PPD与PBSOD值的差值＜0.35，或与B-PPDOD值的差值＜0.25时，判为阴性。8废弃物的处理按照GB19489—2008的规定执行。9检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2—2004的规定执行。10操作注意事项10.1除100倍浓缩的结合物外，所有待检血浆和试剂在使用前应恢复至室温(22℃±5℃)。解冻的样品需小心涡旋，充分混和。加热的温度不应超过37℃。室温水浴箱可缩短平衡时间。10.2试剂盒内所有试剂均应储存于2℃～8℃，使用完后即放回2℃～8℃低温冰箱中。放于室温(22℃±5℃)的工作浓度的洗液应两周内用完。10.3100倍浓缩的结合物和稀释后的结合物应放置在2℃～8℃低温冰箱中。10.4为保证试验效果，应使冻干试剂完全溶解，溶解后的试剂至少需放置15min，然后轻轻颠倒混合4～5次；也可以使用滚动振荡装置混合。使用前需再次混匀。10.5采用去离子水或双蒸水溶解或稀释试剂。DB37/T3571—20194AA附录A（资料性附录）血液处理所需材料肝素真空管10mL或20mL注射器无菌的24孔组织培养板100～1000μL吸头1.5mL离心管Bovigam牛型提纯结核菌素(B-PPD)，300头动物1支Bovigam禽型提纯结核菌素(A-PPD)，300头动物1支无菌的磷酸盐缓冲液（0.01MpH7.2）DB37/T3571—20195BB附录B（资料性附录）ELISA试验所需试剂酶标板(包被IFN-γ抗体)牛γ干扰素阳性对照(含0.01%的硫柳汞)牛γ干扰素阴性对照(含0.01%的硫柳汞)样品稀释液(血浆稀释缓冲液，含0.01%硫柳汞）20倍洗液(含0.01%的硫柳汞)100倍酶标结合物(含0.01%的硫柳汞)酶标抗体稀释液(酶标结合物稀释缓冲液，含0.0l%的硫柳汞）底物缓冲液(含H2O2)100倍浓缩的显色剂溶液(含溶于DMSO的TMB）终止液(0.5MH2SO4)DB37/T3571—20196CC附录C（资料性附录）检测所需仪器37℃培养箱精密可调移液器（200μL、1mL）1mL、5mL、10mL的移液器100mL、1L、2L的量筒12道移液器(50μL-300μL)微量振荡器洗板机酶标仪(含450nm和650nm滤光片)DB37/T3571—20197DD附录D（规范性附录）检测所用试剂的配制D.1抗原牛型提纯结核菌素和禽型提纯结核菌素在使用前彻底混匀，独立分装(0.3mg/mL）。D.2酶标板酶标板在未开封前恢复至室温，可放置30min以上。D.3阳性对照和阴性对照用1mL去离子水或蒸馏水溶解阴、阳性对照。应保证完全溶解，溶解的阴阳性对照在3个月内可储存于2℃～8℃，但再次使用前应恢复至室温并充分混匀。D.4样品稀释液恢复至室温并充分混匀，用作血浆稀释缓冲液。D.5酶标结合物用0.5mL去离子水或蒸馏水溶解100倍浓缩的冻干酶标结合物。100倍浓缩的酶标结合物必须一直保存于2℃～8℃，溶解后的酶标结合物应在3个月内用完。酶标抗体稀释液可直接使用。按表D.1配制酶标结合物工作液，配制完后应在5min内使用，未用完的试剂应立即丢弃。未用完的100倍浓缩的酶标结合物应立即放回至2℃～8℃条件下保存。表D.1酶标结合物配制表酶标板数量浓缩酶标结合物(100倍)的体积酶标抗体稀释液的体积10.12mL12mL20.24mL24mLD.6洗液配制工作浓度的洗液，将19份去离子水或蒸馏水加入1份20倍浓缩的洗液中，充分混匀。工作浓度的洗液可在室温贮存2周，未用完的20倍浓缩洗液应放回至2℃～8℃条件下保存。20倍浓缩洗液可能含有结晶盐，如出现结晶，应于37℃重新溶解结晶。D.7底物溶液DB37/T3571—20198将