DB37T 3573-2019 牛支原体诊断技术规程

ICS11.220B41DB37山东省地方标准DB37/T3573—2019牛支原体诊断技术规程CodeofPracticefortheDiagnosisofMycoplasmaBovis2019-05-29发布2019-06-29实施山东省市场监督管理局发布DB37/T3573—2019I目次前言................................................................................II1范围...............................................................................12规范性引用文件.....................................................................13术语与定义.........................................................................14试剂及仪器.........................................................................14.1试剂...........................................................................14.2仪器...........................................................................25样品采集与处理.....................................................................25.1疑似牛支原体感牛只的判断.......................................................25.2疑似病例样品的采集.............................................................25.3样品处理.......................................................................26微生物学检测法.....................................................................26.1液体培养.......................................................................26.2菌落形态观察...................................................................26.3Dienes染色.....................................................................36.4生化试验.......................................................................36.5结果判定.......................................................................37核酸检测法.........................................................................37.1DNA模板的制备..................................................................37.2PCR检测........................................................................37.3凝胶电泳.......................................................................47.4质量控制.......................................................................47.5结果判定.......................................................................48废弃物的处理和检测过程中安全措施...................................................49操作注意事项.......................................................................5附录A（规范性附录）培养基的制备方法............................................6DB37/T3573—2019II前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、中国农业科学院兰州兽医研究所、威海市畜牧兽医局。本标准主要起草人：张亮、杨宏军、解晓莉、孙阳阳、储岳峰、赵国清、程凯慧、楚会萌、刘来兴、杨美。DB37/T3573—20191牛支原体诊断技术规程1范围本标准规定了牛支原体诊断技术的术语和定义、试剂及仪器、样品的采集与处理方法、生化鉴定方法、核酸检测方法和操作注意事项等。本标准适用于牛支原体的实验室诊断。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB6682—2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T14926.8—2001实验动物支原体检测方法GB15981—1995消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB19489—2008实验室生物安全通用要求3术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3.1牛支原体Mycoplasmabovis柔膜菌纲支原体目支原体科支原体属，可引起成母牛乳腺炎、犊牛肺炎和关节炎等多种疾病的病原之一。3.2Dienes染色液一种经典的利用天青美蓝染色检测支原体的染色液。3.3类胸膜肺炎微生物培养基Pleuropneumonia-LikeOrganismsmedium，PPLO培养基该培养基主要成分为牛心汤、酵母浸出物、牛肉膏等，不含精氨酸、酚红、葡萄糖等成分，主要用于多种支原体的分离和培养。4试剂及仪器4.1试剂DB37/T3573—20192去离子水（符合GB6682—2008的相应要求）；牛支原体检测培养基所需试剂及配制方法见附录A；TaqDNA聚合酶及其反应缓冲液；生理盐水；Dienes染色液；TAE电泳缓冲液；琼脂糖4.2仪器接种环、酒精灯、移液器（5～100μL和100～1000μL）、枪头（200μL和1mL）、培养试管（15mL）和玻璃平皿（90mm）、CO2恒温培养箱、移液器、1L容量瓶、核酸扩增仪、电泳仪、高压灭菌锅、正置光学显微镜。5样品采集与处理5.1疑似牛支原体感牛只的判断肺炎型，主要表现为咳嗽、喘，有清亮或脓性鼻液，伴随出现关节炎或角膜结膜炎；不同病死牛只的病变差异较大，通常病牛心叶及部分膈叶的局部红色肉变，或同时有化脓灶散在分布。乳腺炎型，主要表现为临床型乳腺炎和隐性乳腺炎，前者乳汁带血或呈灰色，后者体细胞数较高，无明显临床症状，但多数情况下单纯感染无明显的红肿热痛。关节炎型，主要表现为犊牛膝关节肿大、跛行，关节炎淡黄色或浓稠，常与肺炎性伴随发生。5.2疑似病例样品的采集根据“5.1”所述牛支原体感染的三种临床表现型，分别进行样品的采集，具体要求如下：a)肺炎型：应采集新病死牛只的肺部实变部分或病牛的鼻腔液，置专用采样器或无菌容器中；b)乳腺炎型：采集前，应弃病牛的前三把奶，再采集病牛乳汁约15mL，置注射器或无菌容器中；c)关节炎型：对采集部位进行消毒后穿刺吸取关节液约2mL～5mL，置注射器或无菌容器中。5.3样品处理组织样品的处理剪至云雾状后，用2mL生理盐水重悬，7500g离心5min，用注射器吸取1mL上清液经0.45μm滤膜滤过后备用。鼻拭子的处理用2mL生理盐水浸润拭子后，7500g离心5min，吸取1mL上清液经0.45μm滤膜滤过后备用。奶样或关节液样品的处理分别取1mL原液与1mL生理盐水充分混合，7500g离心5min，用注射器吸取1mL上清液经0.45μm滤膜滤过后备用。6微生物学检测法6.1液体培养将0.5mL“5.3”所述处理所得上清液加入到含4.5mLPPLO液体培养基的试管中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养3天，选择PPLO液体培养基由红色变为黄色且透亮的培养液用于进一步检验。6.2菌落形态观察DB37/T3573—20193取50μL疑似液体培养阳性的样品加入到PPLO固体培养基（配方见附录A）上，涂布均匀后，置于37℃，5%CO2培养箱中培养3～5天后，4倍物镜下观察菌落形态。6.3Dienes染色将有可疑菌落的固体培养基平皿进行Dienes染色，37℃孵育30min后，观察菌落颜色。6.4生化试验洋地黄皂苷敏感试验将“6.1”中变为黄色的培养液，1:10接种于含0.2mg/mL洋地黄皂苷的PPLO液体培养中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养3天，观察培养基颜色变化。当培养基颜色不变时，说明洋地黄皂苷敏感；当培养基颜色变黄时，说明洋地黄皂苷不敏感。葡萄糖发酵试验葡萄糖发酵试验培养基配制方法见“附录A”。将“6.1”中变为黄色的培养液，1:10接种于葡萄糖发酵试验培养基中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养3天，观察培养基颜色变化。当培养基颜色不变时，说明不发酵葡萄糖；当培养基颜色变黄时，说明发酵葡萄糖。精氨酸水解试验精氨酸水解试验培养基配制方法见“附录A”。将“6.1”中变为黄色的培养液，1:10接种于精氨酸水解试验培养基中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养3天，观察培养基颜色变化。当培养基颜色不变或变黄时，说明不水解精氨酸；当培养基颜色变红时，说明水解精氨酸。6.5结果判定当同时满足以下条件时，判定为牛支原体阳性：a)镜检存在圆形、中间有颗粒或隆起的煎蛋样菌落；b)Dienes染色菌落为蓝色；c)生化鉴定结果为洋地黄敏感、不能发酵葡萄糖、不能水解精氨酸。其他情况均视为牛支原体阴性。7核酸检测法7.1DNA模板的制备水煮法取“5.3”所述的上清样1mL于灭菌的2mLEppendorf管中，12000g离心12min，弃上清，沉淀重悬于200μL无菌ddH20中，沸水浴15min后立即冰浴2min，待Eppendorf管冷却后12000g离心10min，取上清液即为样品DNA模板。试剂盒法提取样品DNA模板时，采用商品化的支原体基因组DNA提取试剂盒或革兰氏阴性菌基因组DNA提取试剂盒进行提取，操作步骤参照商品化试剂盒说明书。7.2PCR检测DB37/T3573—20194PCR反应引物参照国际上常用的PCR诊断方法，选择针对牛支原体设计的一对特异性引物用于PCR检测（Subramaniam,etal.Molecular&CellularProbes,1998.），目标产物大小为1626bp，引物信息如下：MBOUVRC2-L：5’-TTACGCAAGAGAATGCTTCA-3’MBOUVRC2-R：5’-TAGGAAAGCACCCTATTGAT-3’PCR反应体系经“7.1”提取的样品DNA模板，以牛支原体DNA作为阳性对照，ddH2O为阴性对照。PCR反应体