DB51T 658-2007 猪肉中己烯雌酚残留检测方法-高效液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）

ICS：65.020.30备案号：四川省地方标准DB51/T658—2007猪肉中己烯雌酚残留检测方法－高效液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）法Determinationofdiethylstilbestrolresiduesinmuscleofpigbyhighperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry2007-03-17发布2007-05-01实施四川省质量技术监督局发布DBDB51/T658—2007I目次前言.............................................................................II1范围................................................................................12规范性引用文件......................................................................13制样................................................................................13.1样品的制备.........................................................................13.2样品的保存.........................................................................14测定方法............................................................................14.1方法提要或原理.....................................................................14.2试剂和材料.........................................................................14.3仪器和设备.........................................................................24.4测定步骤...........................................................................24.5结果计算和表述.....................................................................35检测方法灵敏度、准确度、精密度......................................................45.1灵敏度.............................................................................45.2准确度.............................................................................45.3精密度.............................................................................4附录A（资料性附录）己烯雌酚特征离子质量色谱图、特征离子质谱图...................5DB51/T658—2007II前言本标准按GB/T1.1—2000《标准的结构和编写规则》进行编制本标准附录是资料性附录本标准由四川省畜牧食品局提出并归口本标准由四川省质量技术监督局批准本标准起草单位：四川省兽药残留监控中心、四川省兽药监察所本标准主要起草人：谢青、彭莉、岳秀英、熊浩山、官艳丽、王海波、吴晓岚DB51/T658—20071猪肉中己烯雌酚残留检测方法－高效液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）法1范围本标准规定了猪肉中已烯雌酚残留检测的制样和高效液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）测定方法。本标准适用于猪肉中己烯雌酚的残留量测定。检出限为0.5µg/kg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T1.1-2000标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则(ISO/IECDirectives,Part3,1997,RulesforthestructureanddraftingofInternationalStandards,NEQ)GB/T6682-1992分析实验室用水规则和试验方法农牧发[2003]1号兽药残留试验技术规范（试行）3制样3.1样品的制备取适量新鲜或冷冻的空白或供试猪肉组织，绞碎并使之均匀，密封。3.2样品的保存-20℃以下冰箱中贮存备用。4测定方法4.1方法提要或原理猪肉中的己烯雌酚用叔丁基甲基醚提取，正己烷脱脂，OasisHLB固相萃取柱净化，氮气吹干。用高效液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。4.2试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的一级水。4.2.1己烯雌酚（DES）含己烯雌酚(C18H20O2)不得少于99%4.2.2叔丁基甲基醚色谱纯4.2.3乙腈色谱纯4.2.4甲醇色谱纯4.2.5正己烷4.2.6氨水4.2.7己烯雌酚标准贮备溶液取己烯雌酚标准品约10mg，精密称定，用甲醇溶解并稀释成浓度为1mg/mL的标准贮备液，置-20℃保存，保存期不超过1年。4.2.8己烯雌酚标准溶液准确量取己烯雌酚标准贮备溶液适量，用乙腈稀释成浓度为200ng/mL的标准溶液，置4℃冰箱中保存，保存期不超过1个月。4.2.9WatersOasisTMHLB固相萃取柱或相当者500mg，6mL。临用前分别用3mL叔丁基甲基醚、3mL甲醇和3mL水预处理，保持柱体湿润。DB51/T658—200724.3仪器和设备4.3.1液相色谱-串联质谱仪或相当者（配电喷雾离子源）4.3.2天平感量0.01g4.3.3分析天平感量0.00001g4.3.4漩涡混合仪4.3.5振荡器4.3.6组织匀浆机4.3.7冷冻离心机4.3.8固相萃取装置4.3.9旋转蒸发仪4.3.10氮吹仪4.3.11微孔滤膜0.22µm4.3.12离心管20mL、50mL4.4测定步骤4.4.1试料的制备试料的制备包括：——取绞碎后的供试样品,作为供试试料。——取绞碎后的空白样品,作为空白试料。——取绞碎后空白样品,添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。4.4.2提取取10000r/min匀浆1min的试料（5±0.05）g，置50mL离心管中，加叔丁基甲基醚15mL，涡旋1min，振荡10min，在-4℃以6000r/min离心10min，将上层清夜移至鸡心瓶中。再加叔丁基甲基醚15mL同法操作，合并两次上清液，于45℃水浴中减压旋转蒸发至干。4.4.3净化加80%乙腈溶液2mL于鸡心瓶中，旋涡溶解残留物，然后将其转移至10mL离心管中。加正己烷5mL于鸡心瓶中洗涤一并转移至鸡心瓶中，震荡混合1min，在15℃以6000r/min离心10min，弃去上清液。再加正己烷5mL于离心管中同法操作，留下层备用。取上述净化后的下层溶液，以每3～4秒1滴的流速通过预处理后的HLB固相萃取柱，先用甲醇：水（3+7）溶液3mL冲洗，然后加水3mL平衡，再用甲醇:2%氨水(1+9)溶液3mL冲洗，弃去洗液，抽干。用甲醇:叔丁基甲基醚(1+9)溶液7mL洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用80%乙腈1mL溶解残余物，充分涡旋，用0.22µm滤膜过滤，滤液供高效液相色谱-串联质谱仪测定。4.4.4标准曲线的制备精密量取己烯雌酚标准溶液，用乙腈稀释制得浓度为0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的系列标准工作溶液，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。4.4.5测定4.4.5.1液相色谱条件色谱仪：Waters_2695高效液相色谱仪或相当者色谱柱：symmetryTMC18(2.1mm×150mm，5µm)或相当者柱温：30℃流速：0.2mL/min进样量：20µL运行时间：15min流动相：A：乙腈，B，水GradienTableDB51/T658—20073Time(min)FlowRate(mL/min)A(%)B(%)CurveInitial0.24060140.2955680.29556150.2406014.4.5.2质谱条件质谱仪：WatersQuattroPremierXE或相当者电离模式：ESI-扫描方式：负离子扫描检测方式：多反应检测电离电压：2.8KV源温：110℃雾化温度：350℃。锥孔气流速：50L/h；雾化气流速：450L/h；数据采集窗口：15min驻留时间：0.2sec定性、定量离子及对应的锥孔电压和碰撞电压见表1。表1己烯雌酚定性、定量离子对和锥孔电压及碰撞电压药物定性离子对(m/z)定量离子对(m/z)锥孔电压(V)碰撞电压(eV)己烯雌酚（DES）267.1/251267.1/2222830267.1/222354.4.5.3测定法取试样溶液和相应的标准溶液，作单点或多点校准，按外标法以峰面积计算，即得。对照溶液及试样溶液中己烯雌酚的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。标准溶液的总离子流和选择离子流图分别见附录A中图A.1。4.4.6空白试验除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。4.5结果计算和表述按下式计算试样中己烯雌酚的残留量：式中:X——试样中己烯雌酚的残留量(ng/g)；A——试样溶液中己烯雌酚的峰面积；AS——标准溶液中己烯雌酚的峰面积；cs——标准溶液中己烯雌酚的浓度(ng/mL)；V——溶解残余物的体积(mL)；m——供试试样的质量(g)。ACsVX=————AsmDB51/T658—20074注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。5检测方法灵敏度、准确度、精密度5.1灵敏度本方法在猪肉中的检测限为0.05µg/kg，最低检出限为0.5µg/kg。5.2准确度本方法在猪肉中0.5µg/kg～2µg/kg添加浓度的回收率为50%～120%。5.3精密度本方法的批内变异系数CV≤11.1%；批间变异系数CV≤9.0%。DB51/T658—20075附录A（资料性附录）己烯雌酚特征离子质量色谱图、特征离子质谱图图A.1己烯雌酚标准溶液（0.5µg/kg）特征离子质量色谱图图A.2己烯雌酚特征离子质谱图