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的ICS65.020.30B43宁波市地方标准DB3302DB3302/T068—2008奶牛胚胎移植技术操作规范2008-12-30发布2009-01-01实施宁波市质量技术监督局发布食品伙伴网—2008I前言本标准附录D为规范性附录，附录A、附录B、附录C为资料性附录。本标准由宁波市畜牧兽医局提出。本标准由宁波市农业局归口。本标准起草单位：宁波市畜牧兽医局、宁波科元家畜胚胎科技有限责任公司。本标准主要起草人：徐震宇、曾宏杰、严竞天、翁宇挺、王国龙、庄景、项益锋、王亚琴。食品伙伴网—20081奶牛胚胎移植技术操作规范1范围本标准规定了奶牛胚胎移植技术操作的基本原则、要求和方法。本标准适用于宁波市奶牛胚胎移植技术的规范化操作。其他牛的胚胎移植可参照本标准执行。2术语和定义本标准采用下列术语和定义。2.1受精卵精子和卵子通过受精结合为合子，称为受精卵，简称“卵”。2.2同期发情利用某些激素制剂处理，人为地控制并调整发情周期使之同期化的方法，称为同期发情。2.3超数排卵应用外源性促性腺激素诱发卵巢多个卵泡发育，并排出具有受精能力的卵子的方法，称为超数排卵，简称“超排”。3超数排卵和人工授精3.1供体牛的选择3.1.1供体牛应符合荷斯坦奶牛的品种标准，遗传品质优良，具有较好的生产性能，要求年产奶量在7.5t以上。3.1.2供体牛一般选择2胎～5胎的经产奶牛，个体繁殖性能良好，有明显发情周期，并要求在产后2个月以上，子宫恢复良好。3.1.3供体牛无传染病及难产、流产等繁殖病史，不得患有子宫内膜炎、卵巢囊肿和子宫过度弛缓、下垂等疾病，长期空怀的母年不得作供体。3.1.4重复超数排卵的供体牛每次处理需间隔60d左右。在连续超数排卵处理4次～5次后需进行配种，以使之妊娠，待产犊后再使用。凡2次超数排卵反应差的母牛不再用作供体。3.1.5供体牛的超数排卵处理应在自然发情或诱导发情的情期第9d～13d进行。凡黄体发育不良，卵巢静止的母牛不宜用。3.1.6应选择性情温顺的母牛作供体，以便于操作。3.1.7冷冻精液要求选择农业部认证种公牛冻精或从国外引入的优秀种公牛冻精，要求遗传基因优良，受精率好，繁殖率高，后裔测定优秀。3.2供体牛的饲养管理3.2.1合理饲养，精心管理，要保证给供体牛足够的优质干草、青贮或多汁饲料、精料以及维生素和矿物质，并供给清洁的饮水和盐。母牛体膘不宜过肥或过瘦，营养要处于平衡状态。3.2.2供体牛在采卵前后要特别注意保持良好的饲管环境，避免不良应激。3.3超数排卵处理食品伙伴网—20082采用促卵泡素（FSH）减量注射法。供体牛在发情后的9d～13d肌注FSH，早晚各一次，间隔12h，分4d减量注射。在第3d时同时宫注PGF2α2.0mg～2.4mg。超排剂量根据不同厂家激素确定适宜剂量，推荐北京动物所总剂量为10mg，宁波激素制品有限公司为566单位。3.4发情观察和人工授精PGF2α处理后40h～48h，大部分供体牛发情。在观察到接受爬跨后4h～6h进行第一次输精，间隔12h后第二次输精。注意输精时不得触摸卵巢，精液输入两侧子宫角或子宫体。4采卵4.1采卵时间以发情日为第0d，在第5d～6d检查卵巢确定黄体数，以便于安排受体头数。第7d（或第6d～8d）非手术回收卵。4.2器械和冲卵液的准备灭菌处理过的冲卵管用PBS液冲洗2次～3次，插入钢芯，检查气球。在无菌间用导管连接吊瓶和集卵杯灌流装置。装入PBS液的吊瓶在37℃水浴中预温待用。准备好必要的麻醉剂、注射器、酒精棉和冲洗消毒剂等。4.3供体牛的保定和麻醉供体牛保定完毕后，在第一、二尾椎骨间酒精消毒，用2%利多卡因3ml～5ml作硬膜外麻醉，或肌注速眠新每一百公斤体重0.1ml。4.4外阴清洗、消毒麻醉后将牛尾竖直绑在保定架上，清除粪便，用清水冲洗会阴部及外阴，再用新洁尔灭消毒液冲洗消毒，用灭菌卫生纸擦干，最后用酒精消毒外阴部。4.5冲卵管的插入和冲卵部位冲胚员要求配备一名助手。助手将准备好的冲卵管交给冲胚员的右手，冲胚员左手食指和拇指扒开阴门插入冲卵管，再将左手伸入直肠，仔细小心地诱导冲卵管经子宫颈进入一侧子宫角至大弯处，抽出少许钢芯，再将冲卵管向前推，使其尖端靠近子宫角深部。由助手持30ml注射器一次推入10ml空气，然后按冲胚员要求，以1ml计数充气。根据子宫大小及冲卵管在子宫的位置确定充气量，一般青年牛充气14ml～16ml，经产牛为18ml～25ml。冲卵管固定后抽出钢芯，开始灌流。4.6灌流方法将吊瓶挂在距外阴部1m高处，接通三通管（Y型）和冲卵管。冲胚员用右手控制进流和出流开关，每次灌注30ml～50ml，由少到多，每侧总量为300ml～500ml。左手通过直肠辅助按摩子宫角。每侧子宫角冲8次～10次。或者用50ml注射器，每次注入30ml～50ml的PBS冲卵液，分次冲洗子宫角，回收后注入加盖量筒。另一侧子宫角的冲洗是由冲胚员右手拉直冲卵管，助手小心插入钢芯。冲胚员的左手在直肠内诱导钢芯插稳后，给气球放气。冲胚员再将冲卵管插入另一侧子宫角，用同样方法冲洗。全过程需在室温（20℃左右）操作。4.7术后处理两侧子宫角冲卵完成后，从气球放出一部分空气，将冲卵管抽至子宫体灌注土霉素溶液（3g土霉素粉溶于100ml灭菌双蒸水或生理盐水）或10ml青霉素（80万u）和链霉素（100万u），拔出冲卵管。5检卵5.1过滤集卵杯法本标准采用日本产的过滤集卵杯。回收结束后，用带4G针头的注射器冲洗滤网2次～3次，吸去杯中的泡沫，置实体显微镜下检查。5.2检卵前的准备食品伙伴网—20083在酒精灯上拉好内径为200μm～300μm的玻璃吸管和玻璃棒,在吸管上连接乳胶管。在小培养皿内做好含10%或20%牛血清的PBS保存液液滴3个～5个，覆盖上液体石蜡油，作好编号，放入培养箱待用。5.3检卵要求室温在20℃～25℃，需2人进行检卵及胚胎鉴定。用玻璃针清除卵外围的粘液、杂质。如果胚胎周围黏连物特别多，先用玻璃针挑去，再进行吹打清洗。用吸管将清洗后的卵移至培养皿的液滴内，同一供体牛的卵放于同一液滴内。然后用吸管先吸入少量第二液滴的PBS保存液至第一液滴，吸入全部卵，防止吸入黏液、杂质，移至第二液滴，依次冲洗卵3次～5次。6胚胎的鉴定和分级6.1胚胎的鉴定6.1.1在体式解剖镜下观察受精卵的形态、分裂球的大小、均匀度、细胞的密度、与透明带的间隙以及变性情况等。6.1.2凡卵子的卵黄未形成分裂球及细胞团的，均列为未受精卵。6.1.3胚胎的发育阶段通常受精后6d～8d非手术回收的正常受精卵发育情况如下：a)桑椹胚：发情后第5d～6d回收的卵，只能观察到球状的细胞团，分不清分裂球，占据透明带内腔的大部分；b)致密桑椹胚：发情后第6d～7d回收的卵，细胞团变小，占透明带内腔60%～70%；c)早期囊胚：发情后第7d～8d回收的卵，细胞的一部分出现发亮的胚泡腔。细胞团占透明带内腔70%～80%，难以分清内细胞团和滋养层；d)囊胚：发情后第7d～8d回收，内细胞团和滋养层界线清晰，胚泡腔明显，细胞充满透明带内腔；e)扩大囊胚：发情后第8d～9d回收，胚泡腔明显扩大，体积增大到原来的1.2倍～1.5倍，与透明带之间无空隙，透明带变薄，相当于正常厚度的1/3；f)孵育胚：般在发情后第9d～11d，由于胚泡腔继续扩张，致使透明带破裂，卵细胞脱出；g)凡在发情后第6d～8d回收的16细胞以下的受精卵均应列为非正常发育卵，不能用于移植或冷冻保存。6.2胚胎的分级分为A、B、C、D四个等级，其中A、B、C三级能够应用于生产上，D级胚胎不用于胚胎移植。a)A级：胚胎形态完整，轮廓清晰，呈球形，分裂球大小均匀，结构紧凑，色调和透明度适中，无附着的细胞和液泡；b)B级：轮廓清晰，色调及细胞密度良好，可见到一些附着的细胞和液泡，变性细胞约占10%～30%；c)C级：轮廓不清晰，色调发暗，结构较松散，游离的细胞或液泡较多，变性细胞达30%～50%；d)D级：未受精卵及早期死亡胚胎。7胚胎的冷冻保存本标准采用一步吸管法。7.1保存液可自配或外购。7.2胚胎装管将胚胎从保存液转入乙二醇冷冻液，用0.25ml塑料吸管按以下顺序吸入：小量的胚胎保存液、气泡、小量保存液，气泡、胚胎冷冻液（含胚胎）、气泡、保存液，气泡、小量保存液，热封无棉塞端。7.3冷冻程序食品伙伴网—20084冷冻仪器采用澳大利亚CL系列5500型，操作程序如下：打开胚胎冷冻仪，当冷冻室温度到–6℃时，放入胚胎细管，置5min后植冰，停留10min，以0.3℃/min的速度降至-30℃，再停留10min后，直接投入液氮，长期保存。7.4塑料吸管的编号用记号笔写上供体品种、牛号、胚胎发育阶段及等级、制作日期（年、月、日），并在外套管上写明序号备查。8冷冻胚胎的解冻本标准采用一步吸管法解冻。8.1解冻方法从液氮中取出装有胚胎的塑料吸管，投入37℃～38℃温水，水浴10s。8.2脱甘油手提塑料吸管，棉塞向下甩2、3次，将气泡甩向棉塞端，使蔗糖液和保存液混合。或者用手指清弹气泡，使两种液体混合。将棉塞向下直立10min。8.3观察胚胎用特制塑料吸管观察镜或显微镜的目镜,通过塑料管壁从上到下转动观察胚胎的形态和位置,确认后用70%的酒精棉球消毒并切除吸管上层1cm,切口要平整,可直接用于移植。9胚胎移植9.1受体牛的选择标准9.1.1受体牛一般为低产荷斯坦奶牛，也可选择黄牛。要求年龄在3～8岁，健康，无疾病，体格较大，膘度好。9.1.2繁植性能正常，有正常的自然发情记录，产后60d以上。9.1.3不使用两次人工受精未孕的牛。9.2受体牛的饲养管理9.2.1精心管理，合理饲养，要求环境清洁，饲草、饲料和饮水等充足新鲜，尽量减少不良刺激。9.2.2集中饲养，组成一定数量的牛群。圈舍内防止过挤，以便于发情观察。9.3供体牛、受体牛的同期发情9.3.1自然发情根据受体牛发情观察，与供体牛发情前后相差一天的牛，可作为受体。9.3.2使用PGF2α（一次宫注）诱发发情一般在供体牛注射PGF2α前一天，给处于情期8d～15d且直检黄体好的受体牛一次宫注PGF2α2mg诱发发情。9.3.3两次PGF2α处理在不考虑发情周期的情况下，可间隔11d，前后两次宫注PGF2α。受体牛的处理日程安排应与供体牛超排处理相吻合。9.3.4发情观察原则上根据母牛接受爬跨确认发情,早、晚各观察一次。对发情牛需做直检以确认卵泡，直检的卵泡直径在10mm～20mm左右，发情后36h内出现排卵。若在发情后36h以后排卵的牛不能用作受体。9.3.5供体牛、受体牛的发情日差移植胚胎时，要求供体和受体牛的发情周期相一致，情期超过±2天不能用于移植。9.3.6按胚胎发育情况选受体牛的发情日差食品伙伴网—20085可将致密桑椹胚移植给发情6d的受体牛，将早期囊胚移植给发情7d的受体牛，将囊胚和扩大囊胚移植给发情8d的的受体牛。9.4移植9.4.1待移植受体牛的检查移植前一天直检黄体，要求其直径在11mm～15mm以上，黄体的手感弹性好，质地软而充实。9.4.2器械准备移植时，先用70%酒精棉球消毒装有胚胎的塑料吸管，然后剪掉封口一端。装入移植枪内，套上保护外套。9.4.3移植前胚胎装管胚胎移植时可用0.25ml吸管分三段吸入PBS保存液，中间由两个气泡隔开，中段含有胚胎。也可用小气泡分成多须装管，胚胎在中段。一步吸管法解冻脱甘油后，用酒精棉球多次消毒吸管，剪去封口即可用于移植。9.4.4