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PCR引物设计流程详解本文目：复制出IL-4基因片段一、查找基因序列1、进入NCBI主页，下拉选框选取Nucleotide，在搜索栏输入要查找目基因，即IL-4，点击搜索2、在搜索成果选取灵长类（Homosapiens）2、在灵长类IL-4基因中选取需要mRNA序列3、查看基因有关信息外显子区域CDs区域4、点击FASTA格式，并将序列保存到文档二、使用primerpremier5.0设计引物1、建立新文献，将所得序列复制进输入框内2、点击搜索按钮，搜索引物3、设立引物设计参数（由于在之前查找基因序列时候获知，外显子区域分别为：1-200、201-248、249-425、426-618，又知在引物设计时引物位置最佳跨越一种内含子，PCR产物长度普通为100-150bp，故设定上游引物位置为201-248，下游引物位置为249-425，产物长度为100-150bp）4、确认条件后，显示搜索成果4、双击选中得分最高引物查看引物状况（上图为上游引物状况，下图为下游引物状况）5、将设计上下游引物复制出来，保存到文档中三、使用oligo6.0对设计引物进行评价1、建立新文献，将从cnki上获得cDNA复制进输入框，并点击accept接受2、接受后显示出该序列有关信息3、点击edit按钮录入用primer设计上游引物，每一次输入新数据后都需要点击accept按钮接受4、同理，录入下游引物5、分析上下游引物二聚体形成状况6、分析上下游引物发卡形成状况7、分析上下游引物GC%8、检测上下游引物与PCR模板其他位置错配状况9、分析PCR整体状况四、引物特异性检查（primerblast）1、进入NCBI主页，并选取blast2、选取primerblast3、在输入框内输入模板序列和上下游引物，并设定对比数据库，点击getprimer进行对比4、查看blast成果Blast成果显示，尽管IL-4与其他基因有相似区，但是引物3’端没有完全互补。故设计引物能特异性扩增出目基因