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地高辛标记寡核苷酸，荧光标记二抗，ISH，冰冻切片操作过程：1、多甲固定：应尽量在半个小时内完毕。（固定期间以24-36小时为宜，避免RNA降解或固定过度。）2、切片:为获得高杂交信号，冰冻切片应切成10um-20um。（选用16um）（切好片子可以保存在-70度中）但是要注意，保存在-70度中切片，拿出来后来，及时在4%多甲中重新固定，避免在重新固定前切片恢复室温。（重新固定10-15min）3、用0.1MPB洗切片3*5min4、切片放入100%乙醇5min，空气中干燥。杂交液：（20ml）藏于-20度20*SSC4ml硫酸葡聚糖4g去离子甲酰胺10ml将她们溶解后，加入如下物质：PolyA（10mg/ml）0.5mlSsDNA（10mg/ml）0.5mltRNA（10mg/ml）0.5mlDTT(1M)2ml50*Denhardts0.2ml上述溶液可以配备后长期贮藏与-20度中，用前预热到37度。杂交溶液：将地高辛加入杂交液中，探针浓度需要摸索（普通是100ng-1000ng/ml，普通是以200ng/ml为起点来摸索条件），所加杂交液体积看切片大小来决定，对于2cm*2cm组织，普通是加50ul，但是对于嗅球，也许30-40ul足够。加好杂交液后来，用盖玻片盖上切片（注意中间不要留有任何气泡），为防止杂交液从盖玻片中流走，注意使切片保持水平，并且注意切片不能干燥，（干燥话杂交会有一种很高背景）在湿盒中37度杂交18小时，这个杂交时间可以延长到40小时来提高杂交信号，但是前提是不能让切片干燥。杂交后解决;制备0.5*SSC和1*SSC（从20*来稀释）并且保证这两种SSC在使用时候温度是55度。注意配备0.5*SSC和1*SSC中具有10mMDTT（将1.2gDTT加入到800mlSSC中）杂交后，用小镊子将盖玻片轻轻移走，然后倒掉杂交液，将切片放入洗液中，在振摇水浴中按照下面规定来洗片：快洗：1*SSC（10mMDTT）室温2*15min：1*SSC（10mMDTT）55度2*15min0.5*SSC(10mMDTT)55度1*10min0.5*SSC（10mMDTT）室温将切片始终放在最后一步溶液中始终到下一步操作。检测：将切片转移到TBS缓冲液中（100mMtris-HCl，150mMNaCl，PH=7.5），将切片在TBS缓冲液中洗3*5min，封闭：（可选）将切片放在封闭液中放置30min（封闭液配方:TBS+0.1%tritonX-100+1%正常绵羊血清（sigma）或者是1%其他适当封闭剂（Roche））,将切片拿出封闭液中，用地高辛抗体和切片在TBS+0.1%tritonX-100+1%正常绵羊血清（sigma）或者是1%其他适当封闭剂（Roche）于室温下孵育至少4小时，然后在TBS中洗3*5min，然后在去离子水洗涤几次以去除盐，最后用抗淬灭剂分片观测原位杂交要做对照;1、切片中mRNA质量（前提是新鲜组织样品）和protocol有效性。①PolyT探针：如果PolyT探针杂交信号很弱话，阐明切片RNA已经降解比较严重。2、杂交特异性对照：①检测探针只是和RNA结合，用RNA酶解决后如果没有杂交信号，则阐明杂交只是和RNA结合。（注意，RNA酶解决应当在固定后来用PBS洗两次*5min及时进行）②用正义和反义探针来杂交，如果用正义探针杂交得不到任何信号，则可以阐明杂交信号是特异性杂交预解决：1、在37℃恒温箱内干燥切片后，滴加5-10μg/ml蛋白酶K，置37℃湿盒内孵育30min，4℃75％酒精漂洗5min中断蛋白酶K活性。普通应用蛋白酶K1μg/ml(于0.1mol/LTris,50mmol/LEDTA,pH8.0缓冲液中)，37℃孵育15~20min，以达到充分蛋白消化作用而不致影响组织形态为目。蛋白酶K还具备消化包围着靶DNA蛋白质作用，从而提高杂交信号。甘氨酸是蛋白酶K抑制剂，惯用0.1mol/L甘氨酸溶液(在PBS中)清洗以终结蛋白酶K消化作用，应用胃蛋白酶(Pepsin)20~100μg/ml(用0.1NHCl配)37℃、30min进行消化，所获实验成果优于蛋白酶K。为保持组织构造，通惯用4%多聚甲醛再固定。2、0.25%醋酸酐10min，经70℃2×SSC漂洗、40℃2×SSC各漂洗15min，2×SSC3min，切片经75-100%酒精梯度脱水。1.蛋白酶K能消化和暴露被遮蔽靶核酸，以增长探针可结合性。蛋白酶K浓度过低，不能使靶核酸有效暴露，浓度过高则组织消化过度，也会影响检测成果。蛋白酶K须用蛋白酶K缓冲液配制(0.1mol/LTris-HClPH8.0，50mmol/LEDTA，经高压灭菌后备用)，蛋白酶K应新鲜配制，低温冰箱内分装保存。蛋白酶K消化组织切片是原位杂交实验流程中重要环节，蛋白酶K浓度应力求精确无误。2.依照组织类型、固定液种类，固定期间和切片厚薄不同，蛋白酶K浓度也存在差别，选用蛋白酶K最佳消化浓度是原位杂交成功必要条件，不可省略预杂交预杂交液;临用前加；△预杂交液不加配制：先以去离子甲酰胺与SSC于室温混合，加入硫酸葡聚糖于50℃促溶，依次加入其他成分。硫酸葡聚糖在室温常需数小时才干完全溶解。有时需旋涡振荡。定容后充分混合。依照使用以便可分装（最佳用铝箔将瓶子包好）存于4℃，可达数月。注意，杂交缓冲液在使用前切忌污染1、将DEPC解决切片经ddH2O漂洗2×5min2、按组织片大小，每张切片滴加40μl杂交液，置37℃温盒内2小时杂交1、抖去甩干杂交溶液，用DAKO魔笔沿组织周边划圈，滴加30μl探针杂交液/每张切片(内含20ng地高辛标记探针)，在某温度下（改温度为：TM-）湿盒内孵育过夜杂交液内加入变性剪切鲑鱼精子DNA在杂交前加入，与其他杂交液分开储存。杂交液能在－20℃保存几种月杂交后解决1、将切片置37℃2×SSC中漂洗2×10min。2.在37℃2×SSC漂洗2×15min、1×SSC漂洗2×15min、0.25×SSC漂洗2×15min，均需用振荡漂洗切片。最适复性温度（Optimunmrenaturationtemperature，TOR）：Tor=Tm–25℃苛刻复性温度：Ts=Tm–(10或15℃)非苛刻复性温度：Tns=Tm–(30或35℃)在2×SSC反映液中，可以依照下列公式计算最适复性温度：TOr=0.51(G+C%)+47℃减低背景染色背景染色形成是诸多因素构成。杂交后(Posthybridization)酶解决和杂交后洗涤均有助于减低背景染色。在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐(aceticanhydride)和三乙醇胺(triethanolamine)中以减低静电效应，减少探针对组织非特异性背景染色。在杂交后漂洗中RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对RNA除去。普通遵循共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。必要注意是漂洗过程中，切勿使切片干燥。干燥切片虽然大量溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强了背景染色。4杂交后漂洗(1)2×SSC液内振动移除盖片。(2)2×SSC55℃10min×2。(3)05×SSC50℃5min×2。(4)缓冲液Ⅱ(含05%封阻试剂，用缓冲液Ⅰ溶解)37℃30min。(5)缓冲液Ⅰ(100mmol/LTrisHCl,150mmol/LNaClpH75)15min,室温。(6)酶标地高辛抗体(1∶5000，应用缓冲液Ⅰ解释)37℃30min。(7)缓冲液Ⅰ15min×2，室温。(8)缓冲液Ⅲ(100mmol/LTrisHCl,100mmol/LNaCl,50mmol/LMgCl2,pH95)室温，2min。(2)杂交后漂洗其目是去除未参加杂交体形成过剩探针,消除与组织或细胞之间非特异性结合探针,减少背景染色,增长信/噪比。将杂交玻片从湿盒(或杂交仪)中取出,用2×SSC将盖玻片洗脱,2×SSC30℃洗2次,每次15min;1×SSC42℃洗2次,每次15min;0过程中切不要使切片干燥。(5)对照实验5×SSC37℃洗2次,每次15min,TBS缓冲液洗2次。注旨在漂洗①阳性对照:用已知含靶核酸序列组织作对照。②阴性对照:用已知不含待测靶核酸序列组织作对照。③用免疫组化检测办法来拟定杂交信号分布。④省略标记探针。⑤DNA酶消化靶DNA对照。〖HJ1〗(6)非特异性染色非特异性染色也许会来自探针、组织内源性酶、组织细胞、显色系统等;探针特异性不高以及组织细胞内某些成分与显示系统中抗体成分非特异结合也可导致非特异性染色。组织细胞内源性酶是原位杂交中非特异性着色重要因素,当前最惯用酶是过氧化物酶和碱性磷酸酶,这两种酶都广泛存在于组织细胞中,因而用这些酶时应有消除内源性酶相应环节。如过氧化物酶用3%H2O2解决5~10min;10%冰醋酸解决组切片10min,或在底物显色液中加入1mmol/L左旋咪唑可防止内源性碱性磷酸酶染色。NBT/BCIP显示碱性磷酸酶时如果在光照下显色也会增强非特异性染色。必要依照检测系统不同标记酶作不同内源酶解决。2.探针长度原位杂交反映中探针浓度应超过靶序列浓度，探针浓度必要予以该实验最大信噪比，由于背景着色度高低与探针浓度关于。最佳探针浓度是最低探针浓度达到靶核酸最大饱和结合度为目。探针浓度按其种类而略有不同，放射性标记cRNA探针浓度为0.5ng/μl，而非放射性标记cRNA探针浓度1.0ng/μl。杂交液量要恰当，每张切片以30-50μl为宜。保持杂交液不流失核心是，载玻片清洁解决必要彻底，应用杂交罩等也很必要。3.杂交温度和时间设立和调节杂交温度是RNA原位杂交重要环节。杂交温度应低于解链或融解温度(meltingtemperatureTm)20-30℃。多数RNA原位杂交Tm为95℃，由于这一温度对保存组织形态完整和组织切片粘附将产生不利影响，为此在杂交液中常以增长甲酰胺浓度来减少Tm值，由于每增长1％甲酰胺浓度可减少0.72℃。此外杂交体中GC比例，杂交体长度以及杂交液中Na+浓度也与Tm呈正有关。杂交反映时间可随探针浓度增长而缩短，杂交时间过短会导致杂交不完全，杂交时间过长会增长非特异性着色。普通RNA原位杂交采用杂交孵育过夜，在黑暗环境下进行，可以避免光线对甲酰胺电离作用。为利于mRNA检测，固定期间不要超过36小时，以免引起RNA与蛋白质之间发生交联。(三)预杂交(1)切片用DEPC解决PBSPH7.4(140mmol/LNaCl，2.7mmolKCl,10mmol/LNa2HPO4，1.8mmol/LKH2PO4)孵育2×5min，再用DEPC解决含100mmol/L苷氨酸(Glycine)PBS孵育切片2×5min。(2)用DEPC解决含0.3%TritonX-100PBS孵育15min。(3)用DEPC解决PBS漂洗2×5min。(4)冰冻切片用TE缓冲液（100mmol/LTris-HCl,50mmol/LEDTAPH8.0）不含RNA酶1μg/ml蛋白酶K，在37℃下通透切片30min。石蜡切片用TE缓冲液配制不含RNA酶5-20μg/ml蛋白酶K，在37℃下通透切片30min。(5)在4℃下用DEPC解决4％多聚甲醛PBS溶液作后固定5min。(6)再用DEPC解决PBS冲洗切片2×5min。(7)切片作酸酐解决，解决液含0.25醋酸酐、0.1mol/L三乙醇胺(TriethanolamineTEA)PH8.0，振荡漂洗2×5min。(8)在37℃孵育切片后，杂交缓冲液冲洗（含50％去离子甲酰胺4×SSC），至少10min。注意事项(1)切片通透化是RNA原位杂交核心环节，特别对回顾性资料尤为重要，因固定液种类和固定期间不同，需作最佳通透化条件摸索，涉及蛋白酶K浓度，孵育时间20-30min之间调节，甚至采用0.2mol/LHCL配制0.1％胃蛋白酶。(2)由于醋酸酐极不稳定，宜将醋酸酐在使用前加到TEA缓冲液中。(3)1×SSC=150mmol/LNaCl,15mmol/LsodiumcitratepH7.2。(四)免疫荧光检