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ICS65.020.30B44DB12天津市地方标准DB12/T863—2019水产微生态制剂解淀粉芽胞杆菌生产技术规程Aquaticprobiotics---TechnicalregulationforproductionofBacillusamyloliquefaciens2019-01-14发布2019-02-15实施天津市市场监督管理委员会发布DB12/T863—2019I前言本标准依据GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求起草。本标准由天津市农业科学院提出并归口。本标准起草单位：天津市农业生物技术研究中心。本标准主要起草人：谢凤行、张峰峰、周可、赵琼、赵玉洁、孙海波、高宝山。DB12/T863—20191水产微生态制剂解淀粉芽胞杆菌生产技术规程1范围本标准规定了解淀粉芽胞杆菌生产中所涉及的生产环境和设备、生产技术流程、质量检测和储运。本标准适用于水产微生态制剂解淀粉芽胞杆菌的生产。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB3095环境空气质量标准GB3838地表水环境质量标准GB20287农用微生物菌剂GB/T26428饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1解淀粉芽胞杆菌bacillusamyloliquefaciens属于芽胞杆菌科，芽胞杆菌属，杆状，有鞭毛，革兰氏阳性菌，芽胞椭圆形，中生或近中生。3.2原菌种theoriginalstrain由单菌落分离纯化，并在固体斜面上繁殖保存的菌种。3.3一级菌种firstclassstrain原菌种在培养皿上活化，挑取单菌落接种至三角瓶中，振荡培养的菌种。3.4二级菌种secondclassstrain三角瓶中的菌种接种至种子罐中，在种子罐中放大培养的菌种。4生产环境和设备要求4.1生产环境4.1.1厂区空气质量符合大气环境质量标准GB3095中Ⅱ类要求。4.1.2发酵用水符合地表水环境质量标准GB3838中Ⅲ类水质要求，冷却水及其他用水符合该标准中Ⅳ类水质要求。4.1.3生产车间配备消毒灭菌设施，菌种储藏室和无菌操作间与生产车间分开。DB12/T863—201924.2生产设备生产设备需为不锈钢发酵罐，体积根据生产规模自定。5生产技术流程5.1生产流程生产技术流程见附录A5.2菌种质量5.2.1用于发酵的菌种应有菌种鉴定报告或菌株来源相关信息。5.2.2在发酵前应先检测菌种的纯度和性能，如不纯或退化，应先进行提纯复壮。5.2.3菌种在上罐生产之前需检测种子罐中菌体的纯度和浓度，不能有杂菌污染，浓度达到每毫升亿级以上。5.3培养基5.3.1原菌种和一级菌种的培养基应保证菌种生长的延滞期短，生长旺盛，碳、氮源营养丰富。5.3.2二级菌种培养基原则上为发酵培养基或接近发酵培养基。5.3.3发酵培养基在保证菌体生长旺盛，利于芽胞形成的前提下，尽量利用来源充足、价格低廉的原料。5.4灭菌5.4.1液体发酵，发酵罐的装液量50%～70%，液体培养基、发酵设备、管道、补料罐等采用高压蒸汽灭菌，灭菌条件为121℃～125℃，0.1MPa～0.15MPa，灭菌20min～30min。5.4.2固体物料含水率50%～60%，121℃～130℃，灭菌1.0h～2.0h。5.4.3灭菌后无菌操作取灭菌后的培养基，制片，染色，镜检，无微生物说明灭菌彻底，若有，需重复5.3的工作。5.5接种摇瓶种子到发酵罐种子接种量为1%～5%，种子罐到发酵罐接种量为5%～7%。接种保证无菌操作，调节进、排气阀，使接种口有气体排出。5.6发酵5.6.1芽胞杆菌的发酵温度为25℃～37℃。5.6.2液体发酵在发酵过程中通入无菌空气，通气量为10m3/h•t～20m3/h•t，搅拌转数80r/min～150r/min。5.6.3芽胞率达到80%以上终止发酵。5.6.4发酵周期24h～48h。5.6.5发酵过程加入天然油脂类或有机硅类消泡剂，可采用蠕动泵添加，也可在配置培养基时加入。5.7发酵后处理发酵后的液体菌剂直接分装，或用沸石粉、凹凸棒土等载体吸附，载体的杂菌率≤1.0×104CFU/g，固体发酵菌剂直接风干。包装容器应灭菌处理。DB12/T863—201936质量检测6.1检测指标每个批次的产品抽样检测包括感官、水分、有效活菌数、芽胞率、杂菌率等指标，检验合格方可出厂。6.2感官检测6.2.1取液体菌剂约250mL（固体菌剂约250g）于无色玻璃杯中，采用目测、鼻嗅的方法进行检验。6.2.2液体菌剂为淡黄色或棕黄色，存放过程中可能出现沉淀，具清淡的腥味；固体菌剂棕色或浅棕色，具有明显的发酵气味。6.3有效活菌数、芽胞率检测6.3.1样品稀释液体菌剂用灭菌0.85%的生理盐水梯度稀释，固体菌剂稀释方法按照GB26428规定执行。6.3.2涂平板有效活菌测定直接用2～3个梯度稀释液（10-6、10-7、10-8）在含淀粉的培养基(参见附录B)上涂平板，每个梯度涂3个平板，芽胞数则将2～3个梯度稀释液80℃处理10min后在含淀粉的培养基(参见附录B)上涂平板。6.3.3培养将涂好的平板在室温中放置15min，使接种物完全被琼脂吸收，倒置于培养箱中37℃培养48h。6.3.4计数选取菌落数在30～300个之间的平板计数，典型的解淀粉芽胞杆菌菌落表面粗糙，不透明，边缘不规则，呈浅米黄色，消耗培养基中的淀粉在菌落周围产生透明圈。芽胞数除以菌数即为芽胞率。6.4杂菌率的测定（好氧或兼性厌氧杂菌）从用来测定有效活菌数且已经过10倍系列稀释的样品中，选取10-5、10-6、10-73个稀释度进行杂菌率测定。平板计数法，按GB20287执行。6.5固体菌剂水分含量测定按GB20287执行。7储运7.1应贮存在通风、干燥、清洁的仓库，仓库内无有害气体、易燃易爆物品及有腐蚀性的化学物品，远离热源。7.2长途运输时，防止日晒、雨淋，避免长期受压和机械损伤。产品不应和易燃、易爆、易腐蚀的物品同车（或其他运输工具）装运。ADB12/T863—20194附录A（规范性附录）解淀粉芽胞杆菌生产技术流程图图A.1解淀粉芽胞杆菌生产技术流程图原菌种一级菌种二级菌种配置培养基接种发酵合格灭菌质量检测合格不合格按规定处理出厂发酵物检测不合格按规定处理发酵后处理纯度和性能检查无菌空气DB12/T863—20195BB附录B（资料性附录）计数用培养基含淀粉培养基成分（每升培养基含量）:——可溶性淀粉：10g；——蛋白胨：10g；——硫酸镁：0.5g；——磷酸氢二钾：1g；——碳酸钙：1g；——琼脂：18g；——蒸馏水：1000mL；——pH:7.0-7.5；——灭菌条件：121℃灭菌20min。_________________________________