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ICS65.150B50DB12天津市地方标准DB12/T865—2019水和沉积物中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱串联质谱法DeterminationofnitrofuranmetabolicresiduesinwatersandsedimentbyLC-MS/MSmethod2019-01-14发布2019-02-15实施天津市市场监督管理委员会发布DB12/T865—2019I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。本标准起草单位：农业农村部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心（天津）。本标准主要起草人：李春青、陈永平、高丽娜、时文博、李宝华。DB12/T865—20191水和沉积物中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱串联质谱法1范围本标准规定了水及沉积物中硝基呋喃类代谢物残留量测定的试剂、仪器设备、测定步骤、计算、方法灵敏度、方法回收率、方法精密度。本标准适用于水和沉积物中3-氨基-2-唑烷基酮（呋喃唑酮代谢物，以下简称：AOZ）、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮（呋喃它酮的代谢物，以下简称：AMOZ）、氨基脲（呋喃西林代谢物，以下简称：SEM）和1-氨基-2-内酰脲（呋喃妥因代谢物，以下简称：AHD）残留量的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理水或沉积物中残留的硝基呋喃类代谢物在酸性条件下水解，用2-硝基苯甲醛衍生化，经乙酸乙酯液-液萃取净化后，液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。4试剂4.1甲醇：色谱纯。4.2醋酸铵：色谱纯。4.3二甲基亚砜：色谱纯。4.42-硝基苯甲醛：色谱纯。4.5三水合磷酸氢二钾：优级纯。4.6乙酸乙酯：色谱纯。4.7乙腈：色谱纯。4.8盐酸：优级纯。4.90.002mol/L醋酸铵溶液：称取0.15g醋酸铵，用水（实验用水当符合GB/T6682规定）溶解并定容至1000mL。4.10甲醇溶液：甲醇：水=5：95(v/v）。4.110.2mol/L盐酸溶液：量取浓盐酸（ρ=1.19g/mL）16.67mL，用水稀释至1000mL。4.120.05mol/L2-硝基苯甲醛溶液：称取0.0378g2-硝基苯甲醛，溶于5mL二甲基亚砜中，现用现配。4.131.0mol/L磷酸氢二钾溶液：称取114g三水合磷酸氢二钾，溶解于500mL水中。DB12/T865—201924.14标准物质AOZ、AMOZ、SEM·HCl和AHD·HCl：纯度≥98%。4.15同位素内标溶液：AOZ-D4、AMOZ-D5、SEM•HCl-13C-15N2和AHD13C3，浓度均为100μg／mL。4.16AOZ（呋喃唑酮代谢物）标准储备溶液：1.0mg/mL：准确称取10.0mg±0.1mgAOZ，用甲醇溶解并定容至10mL棕色容量瓶中，-20℃冷藏保存，有效期6个月。4.17AMOZ（呋喃它酮代谢物）标准储备溶液：1.0mg/mL：准确称取10.0mg±0.1mgAMOZ，用甲醇溶解并定容至10mL棕色容量瓶中，-20℃冷藏保存，有效期6个月。4.18SEM（呋喃西林代谢物）标准储备溶液：1.0mg/mL：准确称取14.9mg±0.1mgSEM·HCl，用甲醇溶解并定容至10mL棕色容量瓶中，-20℃冷藏保存，有效期6个月。4.19AHD（呋喃妥因代谢物）标准储备溶液：1.0mg/mL：准确称取13.2mg±0.1mgAHD·HCl，用甲醇溶解并定容至10mL棕色容量瓶中，-20℃冷藏保存，有效期6个月。4.20硝基呋喃类代谢物混合标准工作溶液：准确吸取AOZ、AMOZ、SEM和AHD标准储备溶液，用水逐级稀释配成100ng/mL和10ng/mL混合溶液，4℃冷藏保存，有效期1个月。4.21硝基呋喃类代谢物混合内标工作溶液：准确吸取同位素内标溶液（4.15），用水逐级稀释配成100ng/mL混合溶液，4℃冷藏保存，有效期1个月。5仪器和设备5.1液相色谱串联四极杆质谱仪：配备电喷雾（ESI）离子源。5.2电子天平：感量0.0001g和0.01mg。5.3涡旋混合器。5.4恒温水浴振荡器：可控温37℃±1℃。5.5离心机：4000r/min。5.6氮气吹干仪。5.7冰箱：具备4℃冷藏功能。6测定步骤6.1样品处理6.1.1水样取充分混匀的水样100mL用0.45μm滤膜过滤，于4℃冰箱保存。6.1.2沉积物取沉积物样品100g，风干至内外部均干燥无水后，研磨成粉状，用80目圆筛筛分去除大型颗粒，于4℃冰箱保存。6.2水解和衍生化6.2.1水样品量取10mL（精确到0.1mL，V2）水样于50mL离心管中，加入0.05mL混合内标工作溶液（4.21）涡旋混合50s，再加入5mL盐酸溶液（4.11）和0.20mL2-硝基苯甲醛溶液（4.12），涡旋振荡50s后，置于恒温水浴振荡器中37℃避光振荡16h。6.2.2沉积物样品DB12/T865—20193称取样品5.00g（精确到0.01g，m），加入0.05mL混合内标工作溶液（4.21）涡旋混合50s，再加入5mL盐酸溶液（4.11）和0.20mL2-硝基苯甲醛溶液（4.12），涡旋振荡50s后，置于恒温水浴振荡器中37℃避光振荡16h。6.3提取净化取出离心管冷却至室温，加入3mL~5mL磷酸氢二钾溶液（4.13），调节pH至7.0~7.5，加入8mL乙酸乙酯，涡旋振荡50s，4000r/min离心5min，取上层清液至20mL玻璃离心管中，再加入8mL乙酸乙酯重复上述操作，合并上清液于40℃下氮气吹干。准确加入1.0mL（V1）甲醇溶液（4.10）涡旋振荡溶解残留物，用0.22μm滤膜过滤，待测。（若样品杂质较多，可考虑定容后用正己烷净化，即加入2mL正己烷涡旋离心后弃去上层，取下清液过0.22μm微孔滤膜，待测）。6.4标准工作曲线制作分别准确移取10ng/mL混合标准工作液（4.20）0.050mL、0.10mL和100ng/mL混合标准工作液（4.20）0.020mL、0.040mL、0.060mL、0.080mL、0.10mL于7个50mL离心管中，除不加样品外，按6.1.2和6.1.3步骤操作，按6.3测定，色谱图参见附录A。6.5测定6.5.1色谱条件色谱柱：C18柱，100mm×2.1mm(i.d.)，5µm，或其他性能相当的色谱柱；柱温：40℃；进样量：20µL；流动相：A.0.002mol/L醋酸铵溶液；B.乙腈；梯度洗脱程序见表1，平衡时间为5min。表1流动相梯度洗脱程序时间（min）A（%）B（%）流速（ml/min）0.085150.251.085150.254.030700.258.030700.258.185150.251085150.256.5.2质谱条件质谱参数应符合以下条件：a)离子化模式：大气压电喷雾离子源（ESI）,正离子模式；b)喷雾电压：4000v；c)雾化气压力：35psi；d)辅助气流量：3L/mine)离子传输毛细管温度：350℃；f)源内碰撞诱导解离电压：10v；g)扫描模式：选择反应监测（SRM），选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量见表2；h)Q1半峰宽：0.7Da；i)Q3半峰宽：0.7Da；j)碰撞气压力：氩气，1.5mTorrDB12/T865—20194表2选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量目标化合物母离子(m/z)子离子(m/z)碰撞能量(v)AOZ（呋喃唑酮代谢物）23610419236134*15AOZ-D4（呋喃唑酮代谢物内标）240134*12AHD（呋喃妥因代谢物）24910420249134*12AHD-13C3（呋喃妥因代谢物内标）252134*15SEM（呋喃西林代谢物）209166*1220919210SEM-13C-15N2（呋喃西林代谢物内标）212168*11AMOZ（呋喃它酮代谢物）33526222335291*14AMOZ-D5（呋喃它酮代谢物内标）340296*12注：*表示为定量离子6.5.3定性依据在同样测试条件下，阳性样品保留时间与标准物质保留时间相对标准偏差在±5%以内，且检测到的离子的相对丰度，用与最强离子（基峰）的强度百分比表示，应当与浓度相当的校正标准相对丰度一致，校正标准可以是校正标准品溶液，也可以是添加了标准物质的样品。次强碎片离子丰度与基峰丰度比应符合表3要求：表3基峰与次强碎片离子丰度比要求次强碎片离子相对丰度（%）允许相对偏差(%)＞50±20＞20～50±25＞10～20±30≤10±506.5.4定量测定定量离子采用丰度最大的二级特征离子碎片（表2）。6.6空白实验除不加试祥外，按上述6.2、6.3测定步骤和6.5测定条件进行测定，色谱图参见附录B。7结果计算7.1用仪器自带工作站按内标法进行自动计算，以化合物上机响应的峰面积与内标物峰面积比值为纵坐标、化合物浓度与内标物浓度比值为横坐标，绘制标准曲线，再根据样品的峰面积响应值与内标物峰面积比值，利用标准曲线，得到样品制备液的实际测定浓度。7.2水样品中硝基呋喃类代谢物残留量按式（1）计算。计算结果须扣除空白值。X=Ci·V1/V2......................................(1)式中：X——样品中硝基呋喃类代谢物的含量，单位为微克每升（μg/L）；DB12/T865—20195Ci——样品制备液中硝基呋喃类代谢物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V1——定容体积，单位为毫升（mL）；V2——样品体积，单位为毫升（mL）。7.3沉积物样品中硝基呋喃类代谢物残留量按式（2）计算。计算结果须扣除空白值。X=Ci·V1/m.......................................(2)式中：X——样品中硝基呋喃类代谢物的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；Ci——样品制备液中硝基呋喃类代谢物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V1——定容体积，单位为毫升（mL）；m——样品质量，单位为克（g）。8方法灵敏度8.1水中四种硝基呋喃类代谢物的检出限为0.1μg/L，定量限为0.2μg/L。8.2沉积物中四种硝基呋喃类代谢物的检出限为1.0μg/kg，定量限为2.0μg/kg。9方法回收率9.1水中添加浓度为0.1μg/L~10μg/L时回收率为75%~110%。9.2沉积物中添加浓度为1.0μg/kg~10μg/kg时回收率为75%~110%。10方法精密度本方法的批内相对标准偏差小于10%，批间相对标准偏差小于15%。11注意事项硝基呋喃类代谢物衍生物对光敏感，以上操作应在避光条件下进行。DB12/T865—20196AA附录A（资料性附录）四种硝基呋喃类代谢物混合标准（2.0ng/mL）特征离子质量色谱图DB12/T865—20197BB附录B（资料性附录）空白沉积物样品特征离子质量色谱图DB12/T865—20198CC附录C（资料性附录）沉积物添加样品特征离子质量色谱图DB12/T865—20199DD附录D（资料性附录）空白水样品特征离子质量色谱图DB12/T865—201910EE附录E（资料性附录）水添加样品特征离子质量色谱图_________________________________