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ICS65.020.20B05DB13河北省地方标准DB13/T2276—2015食用菌母种质量评价及复壮方法2015-12-25发布2016-2-1实施河北省质量技术监督局发布DB13/T2276—2015I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由河北师范大学提出。本标准起草单位：河北师范大学。本标准主要起草人：王立安、张金秀、姚清国、刘红霞、孙艳颖。DB13/T2276—20151食用菌母种质量评价及复壮方法1范围本标准规定了食用菌母种的质量评价、复壮及检测方法。本标准适用于常规人工栽培食用菌母种。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T12728-2006食用菌术语NY/T528-2010食用菌菌种生产技术规程NY/T1845-2010食用菌菌种区别性鉴定拮抗反应NY/T1097-2006食用菌菌种真实性鉴定酯酶同工酶电泳法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1母种老化母种因菌龄过长或培养、保藏条件不适宜等因素而出现的生理衰退现象。具体表现为：培养过程中菌丝生长速度减慢、色泽变暗，容易产生韧质菌皮或分泌色素；栽培时“吃料”速度慢，出菇(耳)提早，菇体(耳片)变薄等。3.2母种退化母种在栽培使用过程中因遗传变异而导致的优良性状下降的现象。具体表现为：培养过程中菌落形状不规则，菌丝稀疏或出现扇变菌落，菌落过早产生色素；栽培时出菇潮次不明显，畸形菇比例上升，产量下降，对不良环境或杂菌的抗性降低等。3.3病毒侵染母种菌丝体因病毒感染而导致代谢生长出现显著的不正常，甚至菌丝体停止生长或死亡的现象。3.4杂菌污染母种受到细菌、放线菌或其他真菌污染的现象。DB13/T2276—201523.5母种复壮对菌丝均一性差、生活力已下降的母种恢复其活力及优良性状的过程。4母种质量评价4.1培养基选择根据母种特性，按NY/T528-2010相关要求及附录A进行选择，配制相应的母种培养基。4.2接种及培养取直径约0.5cm待评价母种菌丝块，接种到平板培养基中央部位；每个菌株3次以上重复。于恒温培养箱中适温培养7d～10d。4.3评价观察接种块长出的菌落及菌丝体长势，并按下列方法作出母种质量评价：a)优质母种：菌落呈规则圆形、菌丝粗壮、长势良好，符合本品种母种应有的特征，可用于生产；b)老化、退化母种：部分菌落菌丝生长不规则或出现明显扇变角或分泌色素较多，可用于提纯复壮；c)淘汰母种：具备下列特征之一的均应淘汰：——接种块菌丝体停止生长或死亡；——部分菌落出现黑褐色、青灰色、黄褐色或红色等颜色的孢子堆，或与母种菌丝体之间存在拮抗反应；——菌丝生长缓慢、散发出难闻的酸臭气味。5母种复壮方法5.1提纯复壮5.1.1母种来源被确认为存在老化、退化现象的母种。5.1.2接种培养从斜面培养基母种中挑取远离接种点下端的菌丝，尽量为圆块，接种到与斜面培养基成分不同的平板培养基中，每一平板可接3～4块。按菌种最适温度要求置恒温培养箱中培养7d～10d后，观察菌落形态。5.1.3复壮操作从形态圆形、规整，菌丝生长旺盛的菌落边缘，用无菌小刀切取菌落边缘的菌丝尖端进行分离移植；也可在显微镜下应用显微操作器把菌丝尖端切下；也可用无菌毛细管截取菌丝尖端。分离物转接到与平板培养基成分不同的平板上。按菌种最适温度要求置恒温培养箱中继续培养。采用相同操作，对菌种进一步提纯复壮，直至菌落完全呈规则圆形且菌丝生长明显加快。DB13/T2276—201535.1.4菌种保藏挑取菌落边缘菌丝，接种到与平板培养基成分不同的试管斜面中。按菌种最适温度要求于恒温培养箱中培养至长满后使用，或当菌丝体生长到占整个培养基表面的70%～80%后，按菌种温型特点于冷藏箱保存。5.2原生质体脱毒复壮5.2.1母种来源被确认为受到病毒侵染，且具锁状联合结构的食用菌母种。5.2.2菌丝体制备从斜面培养基母种中挑取远离接种点下端的菌丝3～5块，接种到适合该菌种生长的最适液体培养基上。静置培养3d～5d后，于150rpm及最适温度下摇床培养5d～7d。用四层纱布过滤收集菌丝体，用0.6M甘露醇洗涤2次，用滤纸吸掉菌丝中多余的液体，将菌丝块至于10mL的容器中。5.2.3原生质体制备按每100mg菌丝加入1mL2%溶壁酶（0.6M的甘露醇配制，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，现用现配）。30℃～34℃水浴，每30min摇晃一次。3h之后，加入等体积0.6M甘露醇，用400目细胞筛过滤，将滤液收集到离心管中，室温、3000rpm离心10min，沉淀即为原生质体。5.2.4原生质体再生用0.6M甘露醇将原生质体悬浮，调整生质体悬液浓度到1×107个/mL。稀释后吸取100μL均匀涂布于适合该菌种生长的最适平板培养基上，于恒温培养箱中最适温度下培养15d～20d。5.2.5复壮母种筛选在载玻片上滴一滴蒸馏水，从菌丝生长旺盛的再生菌落中挑取部分菌丝，充分展开后制临时装片，置显微镜下观察。具锁状联合结构的菌丝即为脱毒复壮试验母种。6复壮母种的检测方法按下列方法对复壮菌种进行检测，具备以下特征的母种为复壮菌种。6.1肉眼观察用肉眼观察，复壮后母种菌丝具有本品种固有色泽和形态特征，如：洁白、粗壮；无任何杂菌等。6.2显微镜检查显微镜下观察复壮母种菌丝体应粗壮，菌丝节较长，呈分枝状；与未复壮前菌丝节很短，菌丝纤细形成对比。6.3菌丝生长速度测定将复壮菌种，转接至PDA或适宜其生长的平板培养基中央，待菌丝形成放射状菌落后，用直径0.5cm的无菌打孔器沿菌落边缘同心圆处取菌丝块，接种到PDA平板培养基上。在平板培养基中部放上1个菌种块，共接种3个平板培养基，即为3个重复。按菌种最适温度要求置恒温培养箱中培养至直径为1cm～1.5cmDB13/T2276—20154后，每隔24h测量菌落直径，连测3d～5d，计算并统计菌丝平均生长速度。复壮后菌丝平均生长速度应高于未复壮前。6.4吃料能力测定将复壮母种接种到盛有适合该菌种生长的、无菌栽培料的大试管或栽培袋中，按菌种最适温度要求置恒温培养箱中培养，7d～10d后观察菌丝生长状况。复壮后母种与未复壮的母种相比，菌块萌发快并迅速向培养料中生长伸展，吃料能力应明显增强。6.5第一潮菇产量测定复壮前后母种采用相同出菇培养基制备栽培袋，发满菌后按食用菌出菇环境要求进行管理，测定第一潮菇产量。复壮后母种第一潮菇产量应高于复壮前。6.6酯酶同工酶图谱参照NY/T1097-2006方法及标准制备复壮前后菌丝体或子实体酯酶同工酶图谱。复壮前后菌丝体或子实体同工酶图谱应具相同谱带；复壮后各酯酶条带应比复壮前着色深。DB13/T2276—20155AA附录A（规范性附录）食用菌母种质量评价及复壮常用培养基A.1常用母种培养基A.1.1PDA培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，饮用水1000mL，pH自然。制法：马铃薯洗净、去芽、切片后，称取200g，加水1000mL，煮至沸腾。15min～20min后双层纱布过滤得马铃薯煮汁。向煮汁中加入葡萄糖、琼脂后，继续加热、搅拌，直至琼脂完全融化。过滤。用90℃～100℃水补足至1000mL。趁热分装试管，封口、包装后，121℃灭菌25min～30min。A.1.2CPDA培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钾1g硫酸镁0.5g，琼脂20g，饮用水1000mL，pH自然。制法：马铃薯去芽、洗净、切片后，称取200g，加水1000mL，煮至沸腾。15min～20min后双层纱布过滤得马铃薯煮汁。向煮汁中加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂后，继续加热、搅拌，直至琼脂完全融化。过滤。用90℃～100℃水补足至1000mL。趁热分装试管或三角瓶，封口、包装后，121℃灭菌25min～30min。PDA、CPDA+木屑煮汁：在PDA、CPDA基础上加200g阔叶树木屑煮汁。A.1.3麦粒、麦麸浸汁培养基配方：麦粒100g或麦麸（或米糠）50g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.2g，酵母膏2g，琼脂20g，饮用水1000mL，pH自然。制法：新鲜麦粒100g或麦麸（米糠）50g，加水1000mL，煮至沸腾约10min，4～6层纱布过滤得麦麸或米糠煮汁。向煮汁中加入葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、酵母膏、琼脂后，继续加热、搅拌，直至琼脂完全融化，过滤。90℃～100℃水补足至1000mL。趁热分装试管或三角瓶，封口、包装后，121℃灭菌25min～30min。A.2常用原种和栽培种培养基A.2.1谷粒培养基配方：谷粒（小麦、谷子、玉米或高粱）98%，石膏2%，含水量52%～55%。制法：谷粒（小麦、谷子、玉米或高粱）加水浸泡6h～12h，吸足水后煮沸至熟而不烂。加入石膏，拌匀后分装。121℃～124℃灭菌2h～2.5h。A.2.2棉籽壳培养基配方：棉籽壳84%，麦麸（或米糠）15%，石膏1%，含水量60%±2%。制法：按配方比例称取原料，干拌均匀后逐渐加水。检测含水量，合格后分装。121℃～124℃灭菌2h～2.5h，或100℃常压灭菌8h～14h。DB13/T2276—20156A.2.3木屑培养基配方：阔叶树木屑78%，麦麸（或米糠）20%，蔗糖1%，石膏1%，含水量60%±2%。制法：按配方比例称取原料，先把糖溶于水，再把麦麸（或米糠）、石膏、木屑混合在一起拌匀，逐渐加入糖水。拌匀后检测含水量，合格后分装。121℃～124℃灭菌2h～2.5h，或100℃常压灭菌8h～14h。A.3出菇试验常用培养基配方参照A.2.2和A.2.3。_________________________________