DB15T 1611-2019 细叶百合组织培养技术规程

ICS65.020.20B05DB15内蒙古自治区地方标准DB15/T1611—2019细叶百合组织培养技术规程Technicalregulationoftissuecultureofliliumpumilum2019-03-15发布2019-06-15实施内蒙古自治区市场监督管理局发布DB15/T1611—2019I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由内蒙古蒙草生态环境（集团）股份有限公司提出。本标准由内蒙古自治区草原生态修复标准化技术委员会（SAM/TC34）归口。本标准起草单位：内蒙古蒙草生态环境（集团）股份有限公司。本标准主要起草人：高秀梅、田志来、马怀林、张永清、李晶晶、白俊梅、崔海鹏、刘思泱。DB15/T1611—20191细叶百合组织培养技术规程1范围本标准规定了细叶百合组织的相关术语和定义、实验室设施与要求、培养基制备和组织培养过程。本标准适用于细叶百合规模化组培育苗生产。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T603-2002化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备NY/T2306-2013花卉种苗组培快繁技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1细叶百合liliumpumilum细叶百合别名山丹、卷莲花，为多年生百合科草本植物。3.2结球培养bulb-inducted将增殖的丛生芽接种到结球培养基中促进鳞茎形成的过程。4实验室设施与要求试验室设计与设施按照NY/T2036-2013，4.1.3执行。5培养基的制备5.1培养基的配制MS培养基母液的配制顺序及比例参见附录A，配制使用蒸馏水。大量元素按照比使用浓度高10～100倍进行配制，微量元素按照比使用浓度高20～1000倍进行配制，作为贮备液。5.2植物生长调节剂母液的配制DB15/T1611—201925.2.1配制植物生长调节剂母液的配制浓度为6-BA0.2mg/L～2.0mg/L，NAA0.1mg/L～0.5mg/L。5.2.2储存配制好的母液贴上标签，注明名称和日期，保存于4℃冰箱中，尽快使用。5.2.3其他物质用3.5g/L卡拉胶作固化剂，3%的食用白糖代替蔗糖作为碳源。5.3培养基的制作5.3.1母液配制按照附录A依次取MS母液，大量元素50ml/L、微量元素5ml/L、铁盐5ml/L、有机成分5ml/L，根据生长要求加入植物生长调节剂（不耐高温的药品，应在培养基灭菌后再过滤灭菌加入），加入3.5g/L卡拉胶、3%的食用白糖，贴上标签，注明名称和日期，保存于4℃冰箱中，尽快使用。5.3.2定容取出母液，用玻璃棒搅拌混匀，加入沸腾的自来水并不断搅拌使卡拉胶和糖溶解，加水至容器刻度（1L或10L）。5.3.3pH值调试定容后调试pH值，用0.1mol/L的HCl或NaOH溶液，调pH为5.8～6.0。配制溶液方法按照GB/T603执行。5.3.4分装将调好的培养基根据不同需求进行分装，增殖培养基规格为容量300ml的培养瓶，每瓶分装60ml～70ml；生根培养基，每瓶分装40ml～50ml。5.3.5封口培养瓶用封口膜或者瓶盖封口，用绳子扎紧或者拧紧。5.3.6灭菌将捆绑好的培养瓶尽快进行高压灭菌，121℃灭菌20min～25min。5.3.7储存灭菌后的培养基标明编号及日期，冷却和凝固后放置观察2d～3d，按灭菌先后顺序使用，且存储时间不超出一个月。6组织培养过程6.1外植体的选取及灭菌DB15/T1611—201936.1.1外植体选取在春季将要出芽或者刚出芽时，取其中层鳞片。6.1.2外植体灭菌外植体灭菌流程为:a)鳞片稍加冲洗去掉泥土；b)在超净台放入无菌容器中；c)在每升滴加2～3滴“Tween-20”的洗涤剂溶液中浸泡60s；d)转入75%的酒精中浸泡30s；e)再用0.15%的升汞溶液处理20min；f)无菌水淋洗3～4次；g)无菌滤纸上吸干水分，直接接入预先配制好的培养基中。6.2培养条件培养温度为：25℃±1℃，光照强度2500Lx，除自然光照外，夜间补光4h/d。6.3初代培养将中层鳞片接入到培养基MS+6-BA0.5mg/L～2.0mg/L+NAA0.1mg/L～0.5mg/L+VC5mg/L中。6.4继代培养将诱导分化出的1cm～3cm不定芽切成单株，接种到增殖培养基MS+6-BA0.2mg/L～2.0mg/L+NAA0.01mg/L～0.3mg/L，约10d后底部开始愈伤化，约45d后可继续继代增殖培养。6.5结球培养将增殖的丛生芽接种于1/2MS+IBA0.5mg/L+2%食用白糖的结球培养基中，诱导鳞茎形成，促进结球。6.6生根培养将长3cm～4cm的组培苗，分成单株接种于1/2MS+IBA0.5mg/L生根培养基上,培养15d～20d后移栽。6.7炼苗将生长健壮、根长到1cm～2cm的组培苗进行炼苗，前2d闭瓶炼苗，而后2d～3d开瓶炼苗。6.8移栽将培养苗从培养瓶中倒出，清水洗净根部残留的培养基，用50ppm的IBA沾根8min后，栽入栽培基质中，基质成分为蛭石+羊粪+磷酸二铵。当组培苗长至3～4片真叶后，可移入假植圃假植或直接定植，在此期可适量施稀释的复合肥。DB15/T1611—20194AA附录A（资料性附录）MS培养基成分表表A.1MS培养基成分表成分MS贮备液配制浓度mg/L每升培养基取用量ml大量元素NH4NO3KNO3CaCl2H2OMgSO47H2OKH2PO4330003800088007400340050微量元素KIH3BO3MnSO44H2OZnSO47H2ONa2MoO42H2OCuSO45H2OCoCl26H2O16612404460172050555铁盐FeSO47H2ONa2EDTA2H2O556074605有机成分肌醇烟酸盐酸吡哆醇烟酸硫胺素甘氨酸20000100100204005_________________________________