DB21T 2468-2015 新城疫免疫抗体监测技术规范

ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2468—2015新城疫免疫抗体监测技术规范TechnicalspecificationformonitoringimmuneantibodyofNewcastledisease2015-04-30发布2015-06-30实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2468—2015I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：王宏燕、赵晓彤、薛树山、闫海滨、马建山、石霖、李清竹、吴运谱、何欣、王志国、赵鹏、李晓楠。DB21/T2468—20151新城疫免疫抗体监测技术规范1范围本标准规定了新城疫免疫抗体监测技术中的样品采集和制备、血凝试验、血凝抑制试验的操作规程和综合判定。本标准适用于新城疫疫苗免疫抗体监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T16550-2008新城疫诊断技术3缩略语下列缩略语适用于本标准。HA：血凝（hemagglutination）HAU：血凝单位（hemagglutinationunit）HI：血凝抑制（hemagglutinationinhibition）4器材与试剂4.1器材：普通天平、分析天平、普通离心机、微型振荡器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器、滴头、96孔90度V形血凝反应板。4.2阿氏液(Alsever'sSolution)：配制方法参见附录A中A.1。4.3pH7.20.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）：配制方法参见附录A中A.2。4.41%鸡红细胞悬液：配制方法参见附录A中A.3。4.5标准新城疫病毒抗原、阳性对照血清和阴性对照血清。5抽样样本量大小的确定5.1无限群抽样样本量n值的计算按照预期新城疫免疫抗体合格率为70%,可接受的最大绝对误差为5%，置信水平为95%，根据公式n=p(1-p)×z2/e2计算出n值，其中z值为95%置信水平对应的标准正态分布1-α/2百分位点，为1.96，将p=0.7、z=1.96、e=0.05计算出n值为323。5.2有限群抽样样本量nα值的计算根据公式nα=n×N/(N+n)，计算出群体实际抽样数量，其中N为群体数量，nα为抽样数量。DB21/T2468—201526样品采集和制备6.1血液采集将鸡侧卧保定后，用酒精棉球消毒翅静脉窝区，在距离翅静脉窝约0.3cm处，使针管与近心端保持45度进针，稍稍将针头轻插进血管，轻拉活塞，当有血液开始被吸出后，保持注射器位置不动，让血液缓缓吸入注射器针管内，达到所需的采血量后，用棉球压迫血管上的伤口约30s。6.2血清分离采集到血液后，立即将针头拔掉，把注射器内的血液沿着试管壁徐徐注入，不能有气泡，也不能振荡。逐一编号，仔细核对，倾斜放置。血液样品夏天在常温下、冬天在25℃～37℃温箱中放置1h左右，析出血清。6.3血清运输运输时将血清与采样记录一同装入隔热坚固、内装适当冷冻剂和防震材料的专用运输容器中。外包装上要加贴生物安全警示标志。6.4血清保存血清保存在-20℃～-70℃低温冰箱中，避免反复冻融。7HA试验方法7.1取新城疫病毒抗原1瓶，加入2mLPBS，充分溶解，制成新城疫病毒抗原悬液。7.2取孔面规整、内壁光滑的96孔90度V型血凝反应板，在A1～C12孔中加入0.025mLPBS。7.3吸取0.025mL新城疫病毒抗原悬液，加入A1～C1孔，吹打3～5次充分混匀。7.4从A1～C1孔吸取0.025mL加入第A2～C2孔，混匀后吸取0.025mL加入A3～C3孔，依次进行倍比稀释至A11～C11孔，最后从A11～C11孔吸取0.025mL弃去。7.5A1～C12孔补加0.025mLPBS。7.6A1～C12孔加入1%鸡红细胞悬液，A12～C12孔为红细胞对照。7.7振荡混匀后，在20℃～25℃的条件下静置40min后观察结果。7.8当红细胞对照孔A12～C12孔中的红细胞呈明显的钮扣状沉到孔底时，判定结果。以完全凝集红细胞的病毒抗原悬液的最大稀释倍数为该抗原的血凝滴度。完全凝集红细胞的病毒抗原悬液的最大稀释倍数为1个血凝单位（HAU）。8HI试验方法8.14HAU抗原配制按照GB/T16550-2008新城疫诊断技术的要求配制4个血凝单位（4HAU）的新城疫病毒抗原。8.24HAU抗原回滴8.2.1取血凝反应板，在A1～C5孔加入0.025mLPBS。8.2.2吸取0.025mL4HAU新城疫病毒抗原，加入A1～C1孔，混匀后倍比稀释至A4～C4孔，混匀后吸取0.025mL弃去。DB21/T2468—201538.2.3A1～C5孔中补加0.025mLPBS。8.2.4A1～C5孔加入1%鸡红细胞悬液，A5～C5孔为红细胞对照。8.2.5振荡混匀后，在20℃～25℃条件下静置40min后观察结果。8.2.6当红细胞对照孔A5～C5孔中的红细胞呈明显的钮扣状沉到孔底时，判定结果。A1～C2孔完全凝集，则4HAU抗原配制准确；仅A1～C1孔完全凝集或A1～C2孔均有红细胞流淌，需补加病毒抗原；A1～C3孔或A1～C4孔完全凝集，需补加PBS。若4HAU抗原回滴出现上述后两种情况，则需要重新回滴，直至回滴准确。8.3HI试验操作8.3.1取血凝反应板，在A1～H11孔加入0.025mLPBS，A12～H12加入0.05mLPBS。8.3.2吸取待检血清0.025mL加入A1～A6孔中，吸取新城疫阳性血清加入A7孔，阴性血清加入A8孔，混匀后，同时倍比稀释至A10～H10，混匀后弃去0.025mL。8.3.3A1～H11孔加入回滴好的4HAU抗原，A11～H11为4HAU抗原对照。8.3.4振荡混匀后，在室温20℃～25℃条件下放置30min。8.3.5A1～H12加入1%鸡红细胞悬液，A12～C12孔为红细胞对照。8.3.6振荡混匀后，在20℃～25℃条件下静置40min后观察结果。9HI效价判定当红细胞对照孔A12～H12孔中的红细胞呈明显的钮扣状沉到孔底，且4HAU抗原对照孔A11～H11孔完全凝集时，进行结果判定。将血凝反应板倾斜，参照对照孔，与红细胞对照孔中的红细胞泪滴大小、流速一致的血清的最高稀释倍数为该血清的HI效价。当阴性血清的HI效价不大于2㏒2，阳性血清的HI效价与已知效价相差1个稀释度范围，HI试验结果判定有效。10免疫抗体结果判定10.1血清HI效价＜5㏒2，判为新城疫免疫抗体阴性；血清HI效价≥5㏒2，判为新城疫免疫抗体阳性。10.2免疫抗体合格数量占检测总数的70%（含）以上，判该群体新城疫免疫抗体合格。DB21/T2468—20154AA附录A（资料性附录）试剂配制A.1阿氏液(Alsever'sSolution)葡萄糖2.05g柠檬酸钠0.8g柠檬酸0.055g氯化钠0.42g加蒸馏水100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa15min高压灭菌，4℃保存备用。A.2pH7.20.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）A.2.1配制25×PB磷酸氢二钠2.74g磷酸二氢钠0.79g加蒸馏水100ml。A.2.2配制1×PBS25×PB40ml氯化钠8.5g加蒸馏水至1000mL，调pH值至7.2，121℃高压灭菌30min或过滤，4℃保存备用。A.31%鸡红细胞悬液采集至少3只无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积的阿氏液混合，用pH7.20.01mol/LPBS洗涤3～5次，每次均以2000rpm/min离心10min，洗涤后再用PBS配制成体积分数为1%红细胞悬液，4℃保存备用。_________________________________