DB21T 3111-2019 水质肠球菌的测定 固定底物技术酶底物法

ICS13.060B21DB21辽宁省地方标准DB21/T3111—2019水质肠球菌的测定固定底物技术酶底物法Waterquality—DeterminationofEnterococci—Definedsubstratetechnologyenzymesubstratemethod2019-02-28发布2019-03-28实施辽宁省市场监督管理局发布DB21/T3111—2019I目次前言...............................................................................II1范围..............................................................................12规范性引用文件....................................................................13术语和定义........................................................................14方法原理..........................................................................15试剂和材料........................................................................26仪器和设备........................................................................27样品..............................................................................38分析步骤..........................................................................39结果计算与表示....................................................................410精密度和准确度...................................................................411质量保证和质量控制...............................................................512废物处理.........................................................................513注意事项.........................................................................5附录A...............................................................................6DB21/T3111—2019II前言本标准依据GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》起草制订。本标准附录A为规范性附录。本标准由大连市市场监督管理局提出。本标准由辽宁省生态环境厅归口。本标准起草单位：大连市环境监测中心、国家海洋环境监测中心。本标准主要起草人：王中卫、明红霞、李翔宇、沈学崴、李玉璞、苏洁、曲翊、王琳琳、刘子成、孙沛雯、刘景泰、韩佳。DB21/T3111—20191水质肠球菌的测定固定底物技术酶底物法1范围本标准规定了测定水中肠球菌的固定底物技术酶底物法。本标准适用于地表水、地下水、饮用水、海水、生活废水和工业废水中肠球菌的测定。本标准的检出限：地表水、地下水、饮用水、生活废水、工业废水样品的检出限为1CFU/100ml，海水样品的检出限为10CFU/100ml。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T5750.2生活饮用水标准检验方法样品的采集与保存GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB17378.7海洋监测规范第七部分：近海污染生态调查和生物监测HJ/T164地下水环境监测技术规范HJ/T91地表水和污水监测技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1肠球菌Enterococci41℃培养24h，能产生β-半乳糖苷酶（β-Ｄ-galactosidase），分解选择性培养基中的4-甲基伞形酮-β-Ｄ-葡萄糖醛酸苷（4-methyl-umbelliferyl-β-Ｄ-glucoside，MUG）释放出荧光物质（4-甲基伞形酮）的革兰氏阳性菌。3.2最大可能数mostprobablenumber（MPN）又称稀释培养计数，是一种基于泊松分布的间接计数法。利用统计学原理，根据一定体积不同稀释度样品经培养后产生的目标微生物阳性数，查表估算一定体积样品中目标微生物存在的数量（单位体积存在目标微生物的最大可能数）。4方法原理DB21/T3111—20192在特定温度下培养特定的时间，肠球菌能产生β-半乳糖苷酶，分解荧光底物释放出荧光产物，在366nm紫外灯照射下产生特征性荧光。统计荧光反应出现数量，查MPN表，计算样品中肠球菌的浓度值。5试剂和材料除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，符合GB/T6682三级标准的蒸馏水或去离子水。5.1培养基市售Enterolert培养基，也可以使用其他等效产品。5.2硫代硫酸钠溶液：ρ（Na2S2O3·5H2O）=0.10g/ml称取硫代硫酸钠（Na2S2O3·5H2O）10.0g，溶于适量实验用水，定容至100ml，临用现配。5.3乙二胺四乙酸二钠溶液：ρ（C10H14N2O8Na2·2H2O）=0.15g/ml称取乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2O8Na2·2H2O）15.0g，溶于适量实验用水，定容至100ml，此溶液保质期为30d。5.4无菌水实验用水经121℃高压蒸汽灭菌20min，备用。6仪器和设备6.1恒温培养箱：能够恒温至41℃，控温精度0.5℃。6.2高压蒸汽灭菌器：能够加热至121℃。6.3紫外灯：台式，366nm。6.4封口机：用于定量盘的封口。6.5采样瓶：具螺旋帽或磨口塞的250ml玻璃瓶。6.6三角瓶:100ml。6.797孔定量盘。6.8一般实验室常用仪器和设备。DB21/T3111—20193注：移液管、量筒、采样瓶、三角瓶等玻璃器皿和采样器具应按无菌操作要求包扎，于121℃高压蒸汽灭菌20min，烘干，备用。灭菌后的采样瓶，两周内未使用，需重新灭菌。7样品7.1样品采集与保存按照GB/T5750.2、GB17378.7、HJ/T164和HJ/T91的相关规定进行样品采集。采样后水样应在4℃下冷藏保存，6h内开始检测。7.2干扰和消除7.2.1含活性氯（余氯）的水样，在采样瓶灭菌前需加入0.2ml硫代硫酸钠溶液。7.2.2含重金属的水样，在采样瓶灭菌前需加入0.6ml乙二胺四乙酸二钠溶液。8分析步骤8.1样品稀释根据水样污染程度确定稀释度，避免接种水样经培养后出现全部阳性或全部阴性。接种量小于100ml时，水样应制成稀释样品后使用，接种量为10ml时，以无菌操作方法取10ml水样加入到装有90ml无菌水的三角瓶（6.6）中混匀制成1:10（稀释度）稀释的样品，其它接种量的稀释样品依次类推。注：海水样品至少经1:10稀释后再进行检测。8.2接种以无菌操作方法量取100ml原水样或稀释样品于三角瓶（6.6）中，加入1支培养基（5.1），充分混匀，完全溶解后，全部倒入97孔定量盘（6.7）内，以手抚平定量盘（6.7）背面，去除孔内气泡，然后用封口机（6.4）封口。8.3培养将封口后的97孔定量盘（6.7）放入培养箱（6.1）中培养24h。8.4对照试验8.4.1空白对照使用无菌水（5.4）进行实验室空白测定，培养后的97孔定量盘（6.7）不得有荧光产生，否则，该次样品测定结果无效，应重新测定。8.4.2阴性及阳性对照DB21/T3111—20194阳性菌株参考使用粪肠球菌（Enterococcusfaecalis）,阴性菌株参考使用粘质沙雷氏菌（Serratlamarcescens）和绿脓杆菌（Aerococcusviridians）。将菌株配制成0.5麦氏浊度的菌悬液按照8.2和8.3要求操作，阳性菌株应呈阳性反应（有荧光），阴性菌株呈阴性反应（无荧光），否则该批次测定结果无效，应重新测定。8.5结果判读与计数将培养24h后的97孔定量盘（6.7）进行结果判读，水样在紫外灯（6.3）照射下有荧光，则判断为肠球菌阳性。若结果可疑，可延长培养时间到28h进行结果判读，超过28h后出现的荧光反应不作为阳性结果。9结果计算与表示9.1结果计算从97孔定量盘法MPN表（附录A）中查得每100ml水样中肠球菌的MPN值，再根据样品不同的稀释度进行计算，每100ml水样中肠球菌的计算公式如下：式中：C——每100ml水样中肠球菌浓度，CFU/100ml；MPN值——查表得到的MPN值，CFU/100ml；f——接种样品的稀释度。9.2结果表示测定结果保留两位有效数字，大于等于100时以科学计数法表示，结果单位为CFU/100ml。10精密度和准确度10.1精密度多家实验室分别对肠球菌有证标准样品（221±37CFU/100ml）和低浓度（5CFU/100ml）、中浓度（980CFU/100ml）、高浓度(114500CFU/100ml)实际样品进行了测定，实验室内的相对标准偏差范围分别为：4.3%～5.9%、14%～22%、2.4%～4.0%、1.1%～1.4%；实验室间的相对标准偏差分别为：0.81%、11.2%、0.92%、0.34%；重复性限为0.32、0.42、0.25、0.15；再现性限为0.32、0.46、0.25、0.14。10.2准确度多家实验室对肠球菌有证标准样品（221±37CFU/100ml）进行测定，实验室内相对误差的范围是-1.4%～-2.9%，相对误差的最终值为-2.0%±1.6%。注：微生物检测数据为偏态分布，其测定结果全部经以10为底对数转换后进行计算。DB21/T3111—2019511质量保证和质量控制每批次样品均需进行空白对照试验。每批次实验至少取待测样品数量的10%，进行平行双样分析,其检测所得数值全部经对数（以10为底）转换后数值的相对标准偏差≤25%。不同批次培养基需用有证标准菌株/标准样品进行培养基质量检验，其测定值应在保证值范围内。12废物处理实验产生的废物经121℃高压蒸汽灭菌20min后，作为一般废物处理。13注意事项在进行结果判读时，实验人员应带手套在黑暗环境下进行，确保荧光对准定量盘，避免直射眼睛和皮肤。DB21/T3111—20196附录A（规范性附录）97孔定量盘法MPN表（CFU/100ml）大孔阳性格数小孔阳性格数0123456789101112131415161718192021222324011.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.012.013.014.115.116.117.118.119.120.221.222.223.324.311.02.03.04.05.06.07.18.19.110.111.112.113.214.215.216.217.318.319.320.421.422.423.524.525.622.03.04.15.16.17.18.19.210.211.212.213.314.315.416.417.4