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ICS65.150B51DB21辽宁省地方标准DB21/T3120—2019水产动物物种分子鉴定COI、16SrRNA分子标记法TechnicalspecificationforspeciesmolecularidentificationusingCOIand16SrRNAofaquaticanimals2019-02-28发布2019-03-28实施辽宁省市场监督管理局发布DB21/T3120—2019I前言本标准依据GB/T1.1—2009给出的规则制定。本标准由大连市质量技术监督局提出。本标准由辽宁省农业农村厅归口。本标准主要起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院。本标准主要起草人：高磊、赫崇波、鲍相渤、高祥刚。附录A、B、C为资料性附录。DB21/T3120—20191水产动物物种分子鉴定COI、16SrRNA分子标记法1范围本方法规定了水产动物物种分子鉴定COI、16SrRNA分子标记法的相关术语和定义，标记方式，试剂、仪器和设备，样品采集、保存和前处理，DNA提取和检测，序列扩增和测序，以及物种鉴定的方法。本方法适用于水产动物物种分子鉴定COI、16SrRNA分子标记法。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1水产动物物种分子鉴定aquaticspeciesmolecularidentification指利用分子生物学手段,对水产动物样本（尤其适用于形态学特征相近、模糊或丢失的样本）的分子标记进行分析，鉴定生物种类的过程。3.2聚合酶链式反应polymerasechainreaction（PCR）用一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）为原料，在合适的温度、离子条件和耐热DNA聚合酶催化下，在体外人工合成特异DNA片段的过程。3.3DNA序列测定DNAsequencing测定DNA分子的核苷酸序列。3.4序列比对alignment为确定两个或多个序列之间的相似性和同源性，将他们按照一定的规律进行排列。3.5DB21/T3120—20192DNA条形码-COI细胞色素c氧化酶亚基I（cytochromeccoxidasesubunitI）。3.616SrRNA16S核糖体核糖核酸（16SribosomalRNA）。4标记方式水产动物的COI和16SrRNA的DNA序列进化速度较快，同时又相对保守，可作为分子标记条形码用于物种鉴定。通过PCR技术扩增水产动物的COI和16SrRNA基因部分序列，测序后在已知数据库中进行序列比对，确定物种分类信息。本方法同时对COI和16SrRNA两种分子标记条形码进行分析，并在GenBank（）和BOLDSystem（）两个数据库中比对，确保鉴定成功率和准确率。5试剂、仪器和设备5.1试剂实验仅使用分析纯试剂，水应符合GB/T6682一级水要求。主要包含以下内容：——无水乙醇；——95%乙醇；——TE缓冲液（pH7.6）（100mol/LTris-Cl，pH7.6；10mmol/LEDTA，pH8.0）；——Taq酶（5U/μL）；——超纯水；——10×PCR缓冲液（500mmol/LKCl；100mmol/LTris-Cl，pH8.3；15mmol/LMgCl2）；——引物（10μmol/L）；——dNTP混合液（每种脱氧核糖核苷三磷酸浓度2.5mmol/L）；——溴化乙锭（10mg/mL）；——琼脂糖；——电泳标记物（markers）；——平衡酚；——氯仿/异戊醇（24:1）；——10×Tris硼酸（10×TBE）电泳缓冲液；——灭菌蒸馏水；——液氮；——细胞裂解液（20mmol/L）。5.2仪器和设备实验用仪器和设备主要包含以下内容：——凝胶成像分析系统；——PCR仪；——低温高速离心机（4℃，12000转）；DB21/T3120—20193——稳压稳流电泳仪；——单道可调移液器；——电子天平（0.001g）；——水浴恒温震荡器；——电泳槽；——紫外分光光度计；——遗传分析仪。6样品采集、保存和前处理6.1样品采集、保存样本采集和后续实验应在生物安全实验室进行。选择DNA含量高、多糖等含量低的肌肉、肠道、体腔液、鱼鳍等组织进行采样，样品可通过-20℃冷冻、或4℃冰鲜等方式暂时保存。6.2样品前处理将样品切成5mm左右直径的小块或薄片，用灭菌蒸馏水洗净，按1:10左右比例将样品放入盛有95%乙醇的离心管中，4℃保存。7DNA提取和检测7.1DNA提取7.1.1取0.1g左右样品置于陶瓷研钵中，加少许液氮研碎。将粉末转入400μL~500μL细胞裂解液离心管中，37℃温浴1h后转入50℃水浴3h，期间经常摇动。7.1.2反应液冷却后加500μL平衡酚，缓慢颠倒10min混匀。12000rpm离心15min，转上层水相于新离心管中（重复此过程一次）。7.1.3加氯仿/异戊醇450μL，混匀后12000rpm离心10min。转上层水相于新离心管中，加1/10体积3mol/LNaAc和2.5倍体积无水乙醇，混匀，置于-20℃环境下1h。7.1.412000rpm离心15min，弃上清。以70%冷乙醇洗涤1~2次，真空抽干或自然吹干，加入TE缓冲液溶解，-20℃保存。7.2DNA检测7.2.1纯度检测吸取1μL~3μLDNA，琼脂糖凝胶100V电泳30min，如条带整齐、亮度高，则纯度满足实验要求。7.2.2浓度检测分别于260nm和280nm波长下测定DNA的紫外吸收值。DNA浓度(μg/mL)=[A260/(0.020×L)]×稀释倍数，式中L为比色池厚度，单位cm。DNA浓度在10μg/mL以上时进行后续实验。8序列扩增和测序DB21/T3120—201948.1引物水产动物PCR扩增引物参见附录A。8.2PCR扩增PCR扩增应在以下体系和条件下进行：——PCR扩增体系：10×PCR缓冲液10μL、上下游引物各1μL、DNA提取液5μL、Taq酶0.5μL，dNTP混合液8μL、超纯水定容至50μL；——PCR扩增条件：一个循环反应（95℃5min），30个循环反应（94℃30s，50℃30s，72℃60s），72℃10min，结束PCR反应。8.3测序利用遗传分析仪对PCR产物进行双向测序，得到DNA序列信息。9物种鉴定9.1序列比对鉴定将COI基因序列在GenBank和BOLDSystem中进行核苷酸序列比对，将16SrRNA基因序列在GenBank中进行核苷酸序列比对。比对结果认定如下：——序列比对检出标准为序列相似度≥99%；——综合COI和16SrRNA的比对结果形成最终鉴定结果；——若出现2个及以上比对结果，则选取相似度高且结果一致的鉴定物种作为鉴定结果；——对于鉴定成功的样本，记录于《水产动物物种分子鉴定记录表》（见附录B）；——对于无匹配结果，或结果矛盾的样本，作为未检出样本处理。9.2未检出样本未检出样本记录于《未检出水产动物分类记录表》（详见附录C）。DB21/T3120—20195AA附录A（资料性附录）水产动物物种分子鉴定PCR扩增引物表A.1水产动物物种分子鉴定PCR扩增引物物种引物序列COI基因PCR扩增引物硬骨鱼纲软骨鱼纲F:5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3'R:5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3'甲壳纲F:5'-TATTATTAGACAAGAATCTGGTAAA-3'R:5'-AGGAAATGTTGAGGGAAGAAAGTAA-3'双壳纲腹足纲F:5'-ACAAATCAYAARGAYATYGG-3'R:5'-ACCAATCATAAAGATATTGG-3'头足纲F:5'-ACAAAYCATAAAGAYATTGG-3'R:5'-GTAAATATATGRTGGGCTCA-3'海参纲海胆纲海星纲F:5'-ATAATGATAGGAGGRTTTGG-3'R:5'-GCTCGTGTRTCTACRTCCAT-3'钵水母纲F:5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGAAC-3'R:5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'哺乳纲F:5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3'R:5'-CAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3'爬行纲F:5'-ACTCAGCCATCTTACCTGTGATT-3'R:5'-TGGTGGGCTCATACAATAAAGC-3'通用（选用）F:5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'R:5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'16SrRNA基因PCR扩增引物通用（除甲壳纲和头足纲）F:5'-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-3'R:5'-TCCATAGGGTCTTCTCGTC-3'甲壳纲F:5'-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-3'R:5'-TCCATAGGGTCTTATCGTC-3'头足纲F:5'-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-3'R:5'-TCCATAGGGTCTTTTCGTC-3'注：COI基因PCR扩增引物可选用特异引物或通用引物。DB21/T3120—20196BB附录B（资料性附录）水产动物物种分子鉴定记录表表B.1水产动物物种分子鉴定记录表鉴定人；地点；时间年月日时分至年月日时分序号样本编号样品名称样品来源鉴定结果备注12345678910记事：采样人记录人校对人DB21/T3120—20197CC附录C（资料性附录）未检出水产动物分类记录表表C.1未检出水产动物分类记录表鉴定人；地点；时间年月日时分至年月日时分序号样本编号样品名称样品来源未检出结果备注12345678910记事：采样人记录人校对人_________________________________DB21/T3120—20191参考文献[1]MitaniT,AkaneA,TokiyasuT,etal.Identificationofanimalspeciesusingthepartialsequencesinthemitochondrial16SrRNAgene.Legalmedicine,2009,11:S449-S450.[2]LakraWS,GoswamiM,GopalakrishnanA.MolecularidentificationandphylogeneticrelationshipsofsevenIndianSciaenids(Pisces:Perciformes,Sciaenidae)basedon16SrRNAandcytochromecoxidasesubunitImitochondrialgenes.MolecularBiologyReports,2009,36(5):831-839.[3]NationalCenterforBiotechnologyInformation(US),