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ICS65.120B46备案号：41843-2014DB22吉林省地方标准DB22/T1997—2014饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的测定液相色谱-串联质谱法Determinationofenrofloxacin，ciprofloxacin，norfloxacininfeeds——LC-MS/MSmethod2014-02-28发布2014-04-30实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1997-2014I前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准起草单位：吉林省产品质量监督检验院、吉林大学。本标准主要起草人：李媛媛、刘斌、李滢倩、关树文、刘智、任明月、王颖。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1997-20141饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的测定液相色谱-串联质谱法1范围本标准规定了饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的液相色谱-串联质谱测定。本标准适用于饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的含量测定。本标准方法检出限为10μg/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T20195动物饲料试样的制备3原理用乙腈和磷酸盐缓冲溶液提取试样中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星，固相萃取小柱净化，5%氨水甲醇溶液洗脱，供液相色谱-串联质谱检测，外标法定量。4试剂与材料所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；除另有说明外，水为GB/T6682规定的一级水。4.1甲醇，色谱纯。4.2乙腈，色谱纯。4.3磷酸。4.4甲酸，色谱纯。4.5磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）。4.6磷酸二氢钾（KH2PO4）。4.7氨水。4.8磷酸盐缓冲溶液：称取5.68g磷酸氢二钠(4.5)和1.36g磷酸二氢钾(4.6)置于1000mL烧杯中，加入800mL水溶解，用磷酸（4.3）调至pH=3.0，再用水定容至1000mL。4.9氨水甲醇溶液(5%)：取5mL氨水(4.7)与95mL甲醇(4.1)混合。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1997-201424.10甲酸水溶液(pH=3.0)：量取500mL水，用甲酸（4.4）调pH值到3.0。4.11甲醇水溶液(25%)：取250mL甲醇(4.1)，加水稀释到1000mL。4.12甲醇-甲酸溶液(15+85)：量取30mL甲醇(4.1)与170mL甲酸溶液(4.9)混合。4.13恩诺沙星(CAS：93106-60-6)、环丙沙星(CAS：93107-08-5)、诺氟沙星(CAS：70458-96-7)标准物质，纯度大于等于95%。4.14标准贮备液(1.0mg/mL)：称取0.1g（精确至0.1mg）标准物质(4.13)，至100mL容量瓶，甲醇(4.1)定容。2℃～4℃冷藏保存，可保存6个月。4.15混合标准工作液(1μg/mL)：用甲醇水溶液(4.11)分别配成浓度范围为1ng/mL～60ng/mL标准工作溶液，现配。4.16OasisHLB固相萃取小柱或相当者：60mg，3mL。4.17滤膜：0.22μm。4.18氮气。5仪器5.1液相色谱-质谱联用仪：配有电喷雾电离源。5.2涡旋振荡器。5.3固相萃取装置。5.4分析天平：感量0.1mg。5.5粉碎机。5.6旋转蒸发仪。5.7氮气吹干仪。5.8离心机。6试样制备选取代表性饲料样品至少500g，按照GB/T20195制备试样。7分析步骤7.1提取称取试样0.5g(精确至0.1mg)于50mL具塞离心管中，准确加入6mL磷酸盐缓冲溶液(4.8)，涡旋混匀，再加入10mL乙腈(4.2)，于涡旋振荡器振荡提取1min，5000r/min离心5min，上清液过滤到鸡心瓶中，在残渣中加入5mL磷酸盐缓冲溶液(4.8)，10mL乙腈(4.2)，重复以上步骤，合并上清液，于50℃旋转蒸发，至乙腈全部蒸出。加入5mL磷酸盐缓冲溶液(4.8)，混匀。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1997-201437.2净化固相萃取小柱先用5mL甲醇、5mL水和5mL磷酸盐缓冲溶液(4.8)活化，保持柱体湿润。将7.1的样液以1mL/min的流速全部过HLB固相萃取小柱，待液体完全流出后，先后以4mL水，4mL甲醇水溶液(4.11)淋洗，抽干，用4mL氨水甲醇溶液(4.9)洗脱于10mL具刻度离心管中，洗脱液于50℃，氮吹至约0.2mL时停止浓缩，用甲醇-甲酸溶液(4.12)定容至1mL，5000r/min离心5min,过0.2μm滤膜，供液相色谱串联质谱分析。7.3液相色谱-串联质谱测定7.3.1参考条件a)色谱柱：C8柱1(50mm×2.1mm(i.d)，5µm)，或其他等效柱；b)色谱柱温度：30℃；c)流速：0.2mL/min；d)进样体积：5μL；e)流动相比例：乙睛：0.1%甲酸溶液（15:85）。7.3.2MS/MS参考条件a)离子源：电喷雾（ESI），正离子模式；b)离子喷雾电压：4kV；c)雾化气：氮气，0.25MPa；d)干燥器：氮气，流速10L/min，温度325℃；e)扫描方式：多反应监测（MRM）；f)监测离子：检测离子见表1；g)驻留时间：0.2s；h)脱溶剂气、锥孔气为氮气，碰撞气为高纯氮气；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；锥孔电压、碰撞能量等电压值应优化至最优灵敏度。表1被测物的母离子和子离子参数表化合物中文名称化合物英文名称CAS号定性离子对定量离子对恩诺沙星enrofloxacin93106-60-6360/316360/342360/316环丙沙星ciprofloxacin93107-08-5332/314332/231332/314诺氟沙星norfloxacin70458-96-7320/302320/231320/3027.3.3定性分析按照上述条件测定试样和标准工作溶液，如果试样中的质量色谱峰保留时间与标准工作溶液一致（变化范围在±2.5%之内）；试样中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表1的规定，则可以判断试样中存在待测组分。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1997-20144表2定性离子相对丰度的最大允许偏差7.3.4定量分析在仪器最佳工作条件下，对标准溶液进样，以峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。标准品多反应监测色谱图参见附录A中图A。8结果计算测定结果可由计算机自动计算待测组分的含量，也可按式（1）计算：10001000cVWm´´=´....................................(1)式中：W——试样中被测组分的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；c——由标准曲线查得试液中被测组分的浓度，单位为微克每升（μg/L）；V——试样定容体积，单位为毫升（mL）；m——试样取样质量，单位为克（g）。9精密度在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过算术平均值15%。在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过算术平均值15%。相对离子丰度/%＞50＞20～50＞10～20≤10允许的相对偏差/%±20±25±30±50本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1997-20145AA附录A（资料性附录）MRM质量色谱谱图图A.1三种被测物混合标准溶液总离子流图（1.0mg/L）图A.2诺氟沙星的MRM色谱图（1.0mg/L）本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1997-20146图A.3环丙沙星的MRM色谱图（1.0mg/L）图A.4恩诺沙星的MRM色谱图_________________________________本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印