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ICS07.100.30B20备案号：41840-2014DB22吉林省地方标准DB22/T2052—2014饲料中沙门氏菌测定实时荧光PCR方法DeterminationofsalmonellainfeedstuffsReal-timePCRmethod2014-02-28发布2014-04-30实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2052—2014I前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、王伟、刘晓晖、赵立群、侯宇、柴竹林、张涛。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2052—20141饲料中沙门氏菌测定实时荧光PCR方法1范围本标准规定了饲料中沙门氏菌的实时荧光PCR检验方法。本标准适用于饲料中沙门氏菌的快速筛选检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T13091饲料中沙门氏菌的检验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实时荧光PCRreal-timefluorescentPCR实时荧光聚合酶链式反应。3.2Ct值cyclethresholdvalue每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4原理对样品的增菌培养物进行DNA提取，通过实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅曲线，从而对饲料中的沙门氏菌进行快速检测。5试剂和培养基除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.1引物及探针：a)上游引物：5’-GTGAAATAATCGCCACGTCGGGCAA-3’b)下游引物：5’-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3’本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2052—20142c)探针：5’-FAM-TTATTGGCGATAGCCTGGCGGTGGGTTTTGTTG–TAMRA-3’5.2TaqDNA聚合酶。5.3dNTP：dATP（deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dGTP（deoxycytidinetriphosphate，脱氧鸟苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidinetriphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dTTP（deoxythymidinetriphosphate，脱氧胸苷三磷酸）。5.4细菌基因组DNA提取纯化试剂盒。5.510×PCR缓冲液：含200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化钾（KCl），15mmol/L氯化镁（MgCl2）。5.6缓冲蛋白胨水（BPW）：按GB/T13091中附录规定。5.7沙门氏菌质控菌株：来源于正规菌种保藏机构的标准菌株。如CGMCC1.1859、CGMCC1.1194等。6设备和材料6.1实时荧光PCR仪。6.2生物安全柜：AII型。6.3恒温培养箱。6.4离心机：转速≥12000r/min。6.5核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.6高压灭菌器。6.7恒温水浴锅。6.8天平：感量0.1g。6.9移液器：0.2μL～2μL、2μL～10μL、20μL～200μL、100μL～1000μL。6.10均质器或乳钵。6.11涡旋混合器。6.12实时荧光PCR反应管。6.13离心管：1.5mL。7检测步骤7.1样品制备与增菌参照GB/T13091进行。7.2模板DNA的提取取BPW增菌液1mL于1.5mL无菌离心管中，12000r/min离心5min，尽量吸弃上清液，使用细菌基因组DNA提取试剂盒并按其说明提取制备模板DNA。提取的DNA溶液可于-20℃保存。DNA提取和纯化过程应用无菌水作为核酸提取空白对照。7.3DNA浓度测定取10μLDNA溶液加蒸馏水稀释至1mL，使用核酸蛋白仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值。DNA的浓度按照式（1）计算，当A260/A280比值在1.5～2.1之间时，适宜于PCR扩增。扩增前将所有样品DNA调至10ng/μL～50ng/μL。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2052—20143501000ANc´´=.............................................................................................(1)式中：c——DNA浓度，单位为纳克每微升（ng/μL）；A——260nm处的吸光值；N——核酸稀释倍数。7.4实时荧光PCR检验7.4.1实时荧光PCR反应体系10×PCR缓冲液2.5μL、引物对（10μmol/L）各1μL、探针（10μmol/L）1μL、dNTP（10mmol/L）1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL、模板DNA2μL、用灭菌去离子水补足体积至25μL。7.4.2实时荧光PCR反应条件94℃预变性2min，94℃变性20s，64℃退火延伸1min，同时收集FAM荧光，共进行40个循环。反应产物可在4℃保存。不同仪器、不同TaqDNA聚合酶可根据要求将反应条件做适当调整。检验过程中分别设空白对照、阴性对照、阳性对照。空白对照设为以无菌水代替DNA模板；阴性对照采用非沙门氏菌的DNA作为实时荧光PCR反应的模板；阳性对照采用沙门氏菌DNA作为实时荧光PCR反应的模板。8结果与判断8.1质量控制——空白对照：无扩增曲线，Ct值≥40.0；——阴性对照：无扩增曲线，Ct值≥40.0；——阳性对照：出现典型的扩增曲线，Ct值应≤35.0；否则，视为无效。8.2结果判定——Ct值≥40.0，可判定样品实时荧光PCR结果为阴性。——Ct值≤35.0，可判定该样品实时荧光PCR结果为阳性，按GB/T13091进行确证。——35.0＜Ct值＜40.0，此时应适当增加DNA模板量重做实时荧光PCR检测。重做结果Ct值≥40.0者为阴性，否则实时荧光PCR结果为阳性，按GB/T13091进行确证。9结果表述9.1实时荧光PCR结果阴性，可直接报告未检出沙门氏菌。9.2确证试验结果为检出沙门氏菌，则报告检出沙门氏菌。9.3确证试验结果为未检出沙门氏菌，则报告未检出沙门氏菌。10生物安全措施本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2052—20144为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测沙门氏菌，所有培养物和废弃物应小心处置，并按GB/T27403中的有关规定执行。11废弃物处理和防止污染的措施11.1检验过程中的废弃物需经121℃高压灭菌处理至少30min后再弃置。11.2检验过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403执行。________________________________本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印