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ICS07.100.30B20备案号：41841-2014DB22吉林省地方标准DB22/T2053—2014饲料中构巢曲霉测定实时荧光PCR方法DeterminationofAspergillusnidulansinfeedstuffsReal-timePCRmethod2014-02-28发布2014-04-30实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2053—2014I前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、王莹、郎乐、张庆波、韩冰雪、李媛媛、王庆峰。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2053—20141饲料中构巢曲霉测定实时荧光PCR方法1范围本标准规定了饲料中构巢曲霉的实时荧光PCR检验方法。本标准适用于饲料中构巢曲霉的快速筛选检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T13092饲料中霉菌总数的测定GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实时荧光PCRreal-timefluorescentPCR实时荧光聚合酶链式反应。3.2Ct值cyclethresholdvalue每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4原理对样品的培养物进行DNA提取，通过实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅曲线，从而对饲料中的构巢曲霉进行快速检测。5试剂除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.1引物及探针：a)上游引物：5’-GGCTACACCGAGGACGACAT-3’b)下游引物：5’-CCCGCCTTAGCATCGAAGA-3’本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2053—20142c)探针：5’-FAM-TCAACGGTGACACCCGCTCTT-TAMRA-3’5.2TaqDNA聚合酶。5.3dNTP：dATP（deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dGTP（deoxyguanosinatriphosphate，脱氧鸟苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidinetriphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dTTP（deoxythymidinetriphosphate，脱氧胸苷三磷酸）。5.4真菌基因组DNA提取纯化试剂盒。5.510×PCR缓冲液：含200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化钾（KCl），15mmol/L氯化镁（MgCl2）。5.6高盐察氏培养基：按GB/T13092规定。5.7构巢曲霉质控菌株：来源于正规菌种保藏机构的标准菌株。6仪器和设备6.1实时荧光PCR仪。6.2生物安全柜：AII型。6.3霉菌培养箱。6.4离心机：转速≥12000r/min。6.5核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.6高压灭菌器。6.7恒温水浴锅。6.8天平：感量0.1g。6.9移液器：0.2μL～2μL、2μL～10μL、20μL～200μL、100μL～1000μL。6.10均质器或乳钵。6.11涡旋混合器6.12实时荧光PCR反应管。6.13离心管：1.5mL。7检测步骤7.1样品制备与培养参照GB/T13092对样品进行制备与培养。7.2DNA提取7.2.1DNA模板制备从培养平皿上刮取菌丝0.2g～0.5g于1.5mL离心管，使用真菌基因组DNA提取试剂盒并按其说明提取制备模板DNA。提取的DNA溶液可于-20℃保存。7.2.2DNA浓度测定取10μLDNA溶液加蒸馏水稀释至1mL，使用核酸蛋白仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值。DNA的浓度按照式（1）计算，当A260/A280比值在1.5～2.1之间时，适宜于PCR扩增。扩增前将所有样品DNA调至10ng/μL～50ng/μL。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2053—20143501000ANc´´=.............................................................................................(1)式中：c——DNA浓度，单位为纳克每微升（ng/μL）；A——260nm处的吸光值；N——核酸稀释倍数。7.3实时荧光PCR检验7.3.1实时荧光PCR反应体系10×PCR缓冲液2.5μL、引物对（10μmol/L）各1μL、探针（10μmol/L）1μL、dNTP（10mmol/L）1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL、模板DNA2μL、用灭菌去离子水补足体积至25μL。7.3.2实时荧光PCR反应条件95℃预变性2min，95℃变性10s，60℃退火延伸1min，同时收集FAM荧光，共进行40个循环，反应产物可在4℃保存。不同仪器、不同TaqDNA聚合酶可根据要求将反应条件做适当调整。检验过程中分别设置空白对照、阴性对照、阳性对照。空白对照设为以无菌水代替DNA模板；阴性对照采用非构巢曲霉DNA作为实时荧光PCR反应的模板；阳性对照采用构巢曲霉DNA作为实时荧光PCR反应的模板。8结果判定与报告8.1质量控制——空白对照：无扩增曲线，Ct值≥40.0；——阴性对照：无扩增曲线，Ct值≥40.0；——阳性对照：出现典型的扩增曲线，Ct值应≤35.0；否则，视为无效。8.2结果判定和报告——Ct值≥40.0，可判定样品实时荧光PCR结果为阴性，可直接报告未检出构巢曲霉；——Ct值≤35.0，可判定样品实时荧光PCR结果为阳性，按附录A进行确证。确证试验结果为构巢曲霉，则报告检出构巢曲霉；——35.0＜Ct值＜40.0，此时应适当增加DNA模板量重做实时荧光PCR检测。重做结果Ct值≥40.0者为阴性，报告未检出构巢曲霉。否则实时荧光PCR结果为阳性，按附录A进行确证。确证试验结果为构巢曲霉，则报告检出构巢曲霉。9生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行检测，所有培养物和废弃物应小心处置，并按GB/T27403中的有关规定执行。10废弃物处理和防止污染的措施本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2053—2014410.1检验过程中的废弃物需经121℃高压灭菌处理至少30min后再弃置。10.2检验过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403执行。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2053—20145AA附录A（规范性附录）构巢曲霉确证方法A.1设备A.1.1显微镜：10×～100×。A.1.2目镜测微计。A.1.3物镜测微计。A.1.4无菌接种罩。A.1.5放大镜。A.1.6滴瓶。A.1.7接种钩针。A.1.8分离针。A.1.9载玻片。A.1.10盖玻片：18mm×18mm。A.1.11灭菌刀子。A.2试剂A.2.1乳酸-苯酚液苯酚10g，乳酸（密度1.21kg/m3）10g，甘油20g，蒸馏水10mL。将苯酚在水中加热溶解，然后加入乳酸及甘油。A.3操作步骤A.3.1制片取载玻片加乳酸-苯酚液一滴，用接种针取一小块霉菌培养物（尽量是纯培养物），置乳酸-苯酚液中，用两支分离针将培养物撕开成小块，切忌涂抹，以免破坏霉菌结构；然后加盖玻片，如有气泡，可在酒精灯上加热排除。制片时最好是在接种罩内操作，以防孢子飞扬。A.3.2镜检观察霉菌的菌丝和孢子的形态和特征、孢子的排列等，并做详细记录。A.3.3构巢曲霉形态特征构巢曲霉菌落生长较快，14d直径5cm～6cm，绒状，绿色，有的菌系由于产生较多的闭囊壳而显现黄色，反面紫红色。分生孢子头短柱形，(40µm～80µm)×(25µm～40µm)。分生孢子梗极短，常弯曲，一般75µm～100µm，近顶囊处直径3.5µm～5µm，褐色，壁光滑。顶囊半球形，直径8µm～10µm。小梗双层，梗基(5µm～6µm)×(2µm～3µm)，小梗（5µm～6µm）×(2µm～2.5µm)。分生孢子球形，本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2053—20146粗糙，直径3µm～3.5µm。闭囊壳球形，暗紫红色，直径135µm～150µm。子囊孢子双凸镜形，紫红色，约5µm×4µm，有两个鸡冠状突起。闭囊壳外面包围着一层壳细胞，淡黄色，球形，壁厚，直径约25µm（见图1）。A.4报告根据菌落形态及镜检结果，参照构巢曲霉的形态描述，确定是否为构巢曲霉。图1构巢曲霉_________________________________本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印