DB22T 2972-2019 羊泰勒虫病病原检测 PCR法

ICS11.220B41DB22吉林省地方标准DB22/T2972—2019羊泰勒虫病病原检测PCR法PCRassayfordetectionoftheileriaovis2019-05-27发布2019-06-17实施吉林省市场监督管理厅发布DB22/T2972—2019I前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：延边大学、吉林农业科技学院、吉林省动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：贾立军、田万年、柴方红、梁晚枫、陈健、王海军、王欣睿、李国峰。DB22/T2972—20191羊泰勒虫病病原检测PCR法1范围本标准规定了羊泰勒虫病病原PCR检测方法原理、试剂和仪器、样品采集、操作步骤和判定结果。本标准适用于绵羊泰勒虫病病原检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理双链DNA在高温加热的作用下变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则，通过人工合成的特异性寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链，再利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)合成新生的DNA互补链，进而完成特定片段的体外扩增。4试剂和仪器4.1试剂除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。4.1.1血液DNA提取试剂盒。4.1.210×PCR缓冲液。4.1.3dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP），浓度2.5mmol/L。4.1.4TaqDNA聚合酶，浓度5U/μL。4.1.550×TAE缓冲液见表A.1。4.1.610mg/mL溴化乙锭见表A.2。4.1.71%琼脂糖凝胶见表A.3。4.1.8加样缓冲液见表A.4。4.1.9阴性对照为健康绵羊血液DNA提取物。4.1.10阳性对照为羊泰勒虫感染的绵羊血液DNA或含有目的片段DNA序列，DNA序列参见附录B。4.1.11空白对照为灭菌双蒸水。4.1.12DNAMarker分子量标准。4.2耗材4.2.1抗凝管。4.2.2吸头（200μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL、0.5μL～10μL）。DB22/T2972—201924.2.3Eppendorf管（1.5mL、0.5mL、0.2mL）。4.2.4PCR反应管。4.2.5三角瓶。4.3引物引物序列与浓度见表1。表1引物序列与浓度引物引物序列长度/bp基因序列浓度/μmol/LP1（上游引物）5'-TGATGAGTTGATGTATTGTGGC-3'P2（下游引物）5'-TACCCGCATCCTATTTAGCAG-3'67118SrRNA(AY262119)104.4仪器设备4.4.1微量加样器，单道2μL、10μL、20μL、100μL、200μL和1000μL。4.4.2低温高速离心机，12000r/min以上。4.4.3PCR扩增仪，温度范围为4℃～100℃。4.4.4分析天平，感量0.1mg。4.4.5高压灭菌器，120℃以上。4.4.6微波炉或恒温水浴锅，室温～100℃。4.4.7水平电泳槽。4.4.8电泳仪，电压1V～300V，电流1mA～400mA。4.4.9凝胶成像系统或紫外灯。5样品采集用抗凝管（4.2.1）无菌采集待检绵羊血液样品5mL，编号。冷藏条件下送实验室检测。6操作步骤6.1样品DNA制备按照血液DNA提取试剂盒（4.1.1）操作说明书，提取待检绵羊血液样品基因组DNA、阴性对照（4.1.9）样品基因组DNA和阳性对照（4.1.10）样品基因组DNA。6.2PCR检测在PCR反应管（4.2.4）中依次加入反应试剂，PCR扩增体系为25µL，见表2。混匀后置PCR扩增仪（4.4.3）中，反应条件为96℃预变性5min，94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。同时设定阴性对照、阳性对照和空白对照。DB22/T2972—20193表2PCR检测反应体系试剂体积10×PCR缓冲液2.5µL2.5mmol/LdNTP2.0µL10µmol/L上游引物1.0µL10µmol/L下游引物1.0µL5U/µLTaq酶0.25µL25mg/L样品DNA2.0µL灭菌双蒸水16.25µL总体积25µL6.3PCR产物电泳将1%琼脂糖凝胶（4.1.7）板置于1×TAE缓冲液的电泳槽（4.4.7）中，取加样缓冲液（4.1.8）5µL分别与5µL的待检绵羊血液基因组DNA样品、阴性对照（4.1.9）、阳性对照（4.1.10）和空白对照（4.1.11）的PCR产物混匀后，按编号加入到1%琼脂糖凝胶板的加样孔中，凝胶的边孔中加入标准分子量DNAMarker（4.1.12）。在150V恒定电压下电泳仪（4.4.8）电泳30min后，凝胶成像系统（4.4.9）观察结果。7结果判定7.1条件标准阳性对照出现671bp的DNA扩增条带，标准阴性对照和空白对照无此扩增条带，反应结果成立。参见附录C。7.2结果在阴性对照、阳性对照和空白对照成立条件下，若待检样品出现671bp的DNA扩增条带，判为阳性，报告绵羊泰勒虫感染。若无此DNA扩增条带，判为阴性，报告绵羊泰勒虫未感染。DB22/T2972—20194AA附录A（规范性附录）聚合酶链式反应（PCR）试验常用试剂配制A.150×TAE缓冲液A.1.10.5mol/L乙二铵四乙酸（EDTA）（pH8.0）的配制见表A.1。表A.10.5mol/L乙二铵四乙酸（EDTA）（pH8.0）乙二铵四乙酸二钠18.6g灭菌双蒸水80mL氢氧化钠调pH至8.0灭菌双蒸水定容至100mLA.1.2TAE缓冲液（50×）的配制见表A.2。表A.2TAE缓冲液（50×）配制三羟甲基氨基甲烷（Tris）242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L乙二铵四乙酸（EDTA）（pH8.0）10mL注：加去离子水定容至100mL，室温保存备用，使用时稀释50×为工作液。A.210mg/mL溴化乙锭10mg/mL溴化乙锭的的配制见表A.3。表A.310mg/mL溴化乙锭溴化乙锭0.1g水（H2O）定容至10mLA.31%琼脂糖凝胶A.3.11%琼脂糖凝胶的制备见表A.4。DB22/T2972—20195表A.41%琼脂糖凝胶的制备琼脂糖1g1×TAE缓冲液定容至100mLA.3.2将三角瓶（4.2.5）放在沸水浴或微波炉（4.4.5）中加热至琼脂糖充分溶解（注意用微波炉加热时不要沸出），置室温冷却到50℃左右，加入10mg/mL溴化乙锭10μL，摇匀，倒入电泳板上，凝固后，4℃备用。A.4加样缓冲液加样缓冲液的配制见表A.5。表A.5加样缓冲液溴酚蓝10mg甘油2.5mL0.5mol/LpH6.8三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）缓冲液定容至10mLDB22/T2972—20196BB附录B（资料性附录）M羊泰勒虫18SrRNA基因片段671bp的DNA序列。TGATGAGTTGATGTATTGTGGCTTATTTCGGATGATACTTGTATTATCCGGATGATTACTTTGAGAAAATTAGAGTGCTCAAAGCAGGCTTTTGCCTTGAATAGTTTAGCATGGAATAATAAAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTTAGGTACCAAAGTAATGGTTAATAGGAACAGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACTATGCCGACTAGAGATTGGAGGTCGTCAGTTTTTACGACTCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACAAAGGAAGGATTGACAGATTGATAGCTCTTTCTTGATTCTTTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGGATGCGGGTA说明：横线部分为目的片段PCR扩增上游引物序列，以及下游引物的互补序列。DB22/T2972—20197CC附录C（资料性附录）NPCR扩增产物电泳图见图C.1。M123说明：M——DL2000DNAMarker；1——阴性对照；2——阳性对照；3——空白对照。图C.1D_________________________________2000bp-1000bp-750bp-500bp-200bp--671bp