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ICS65.020.30CCSB41DB13河北省地方标准DB13/T5345—2021猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型二重PCR检测方法2021-01-21发布2021-02-21实施河北省市场监督管理局发布DB13/T5345—2021I前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第一部分：标准化文件的结构与起草规则》的规定起草。本文件由河北农业大学提出。本文件起草单位：河北农业大学。本文件主要起草人：袁万哲、赵款、张建虹、王建昌、韩荞忆、李丽敏、宋勤叶、董世山、李希明、张磊、李睿文、白云、郝雪飘。DB13/T5345—20211猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型二重PCR检测方法1范围本文件规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型二重PCR检测方法的技术要求。本文件适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型的同时检测。2规范性应用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3本文件没有需要界定的术语和定义。4试剂材料4.1病毒核酸提取试剂盒。4.21.0%琼脂糖凝胶，配制方法见附录A中A.1。4.350×TAE缓冲液，配制方法见附录A中A.2。4.4溴化乙锭（EB，10ug/μL）或市售核酸染料，配制方法见附录A中A.3。4.5焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌双蒸水，配制方法见附录A中A.4。4.6DNA分子量标准（100bp）。4.7反转录酶。M-MLV反转录酶（200U/μL）或AMV反转录酶（10U/μL）4.8RNA酶抑制剂。4.92×TaqMasterMix。含有PCR缓冲液、酶混合物、dNTP混合物、无RNA酶的水等。4.10dNTP。浓度为2.5mM。4.11引物。反转录引物、上游引物与下游引物见附录B中的表B.1。引物浓度为10μmol/L。5仪器设备5.1PCR仪。5.2凝胶成像系统。5.3台式低温高速离心机。5.4电泳仪。5.5电泳槽。5.6冰箱。DB13/T5345—202125.7微量移液器。单道可调；量程包括0.5μL～10μL、2μL～20μL、10μL～100μL、100μL～1000μL。5.8水浴锅。6样品6.1阴阳性对照以灭活的猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型细胞培养物或者感染猪组织作为阳性对照，以正常细胞或者是正常猪组织作为阴性对照。对照均应在-20℃保存。6.2样品的采集与处理6.2.1采集工具下列采集工具应进行灭菌处理：a)棉拭子；b)剪刀；c)镊子；d)1.5mL离心管；e)研钵；f)一次性无菌采样袋。6.2.2棉拭子采集将棉拭子深入鼻腔转一圈；将采集后的棉拭子放入盛有1.0mLPBS（配制方法见附录A中A.5）的1.5mL离心管，编号。6.2.3血液采集使用一次性注射器或采血管通过耳静脉或前腔静脉采血3mL～5mL，编号。6.2.4组织采集剖检生猪，用剪刀采集肺、脾、肾、淋巴结等组织，装入一次性无菌采样袋，编号。6.2.5样品储运样品采集后放入塑料袋内密封（一个采集点的样品放一个塑料袋内），样品的储存应按照NY/T541中条款7.1执行；样品的运输应按照NY/T541中条款9执行。6.2.6样品的处理6.2.6.1棉拭子将装有棉拭子的离心管在混合器上充分混合后，用高压灭菌的镊子将拭子中的液体挤出，4℃条件下3000r/min离心15min，取上清液转入无菌的1.5mL离心管中，编号备用。6.2.6.2血液DB13/T5345—20213待血液凝固后，4℃条件下5000r/min离心10min取上清液转入无菌的1.5mL离心管中，编号备用。6.2.6.3组织将所采集的组织置于洁净、灭菌并烘干的搪瓷盘中，称取组织按照质量体积比（1:5）加入样品保存液进行充分研磨，4℃条件下3000r/min离心15min。取上清转入无菌的1.5mL的离心管备用，编号。7PCR检测7.1核酸提取使用商品化病毒核酸提取试剂，按照说明书进行操作。同时进行阴阳对照样品核酸的提取。7.2反转录取6.1所得的核酸11μL，加入2μL10µmol//L的反转录引物（PRRSV-decR）、4μL5×反转录缓冲液、0.5μL反转录酶、0.5μLRNA酶抑制剂、2μLdNTPMixture，42℃水浴1h，即得到cDNA溶液，直接用于后续的PCR扩增或-20℃保存备用。7.3PCR反应在反应管中依次加入6μL无核酸酶水、10μL2×TaqMasterMix、1μL5.2.1的cDNA溶液、1μL6.1中提取核酸、各0.5μL10µmol/L的上游引物（PRRSV-decF与PCV2-decF）、各0.5μL10µmol/L的下游引物（PRRSV-decR与PCV2-decR）。经充分混匀后瞬时离心使液体全部聚集于管底。PCR扩增条件：94℃3min，1个循环；94℃10s，55℃30s，72℃27s，30个循环；72℃5min，1个循环。扩增反应结束后立即进行电泳或置于4℃条件下备用。7.4扩增产物的电泳检测在电泳槽内加入1×TAE电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取3μL～5μL扩增产物加到凝胶孔，加入DNA分子量标准（100bp）。恒压（110V）电泳30min～40min，在凝胶成像系统中观察结果。8结果判定8.1成立条件阳性对照的扩增产物经电泳检测，在440bp和321bp位置均出现特异性的条带；阴性对照的扩增产物在440bp和321bp位置没有特异性的条带。阴阳性对照同时成立表明试验有效，否则试验无效。在试验成立的条件下进行结果判定。PCR产物电泳图见附录C中C.1。8.2结果描述及判定8.2.1如果样品的PCR产物电泳后仅在321bp位置出现特异性的条带，则判定为猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸检测阳性。8.2.2如果样品的PCR产物电泳后仅在440bp位置出现特异性的条带，则判定为猪圆环病毒2型核酸检测阳性。DB13/T5345—202148.2.3如果样品的PCR产物电泳后在440bp和321bp位置均出现特异性的条带，则判定为猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型核酸检测双阳性。8.2.4如果样品的PCR产物电泳后在440bp和321bp位置均未出现特异性的条带，则判定为猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型核酸检测双阴性。DB13/T5345—20215AA附录A（规范性）相关试剂的配制A.11.0%琼脂糖凝胶称取琼脂糖1.0g，放入100mL1×TAE电泳缓冲液中，加热融化，温度降至60℃时，加入5μL核酸染料，均匀铺板，厚度为3mm～5mm。A.250×TAE电泳缓冲液A.2.10.5mol/LEDTA溶液（pH8.0）称取EDTA18.61g，加灭菌双蒸水至100mL，后用氢氧化钠调pH至8.0。A.2.2TAE电泳缓冲液（50×）Tris242g，冰乙酸57.1mL，0.5mol/LEDTA100mL，加灭菌双蒸水至1000mL。A.2.3TAE电泳缓冲液（1×）取50×TAE电泳缓冲液100mL，加灭菌双蒸水至5000mL。A.3溴化乙锭（EB）溶液溴化乙锭20mg，加灭菌双蒸水至20mL。A.4DEPC水焦碳酸二乙酯（DEPC）50μL，加灭菌双蒸水至100mL，室温放置6h～8h，121℃±2℃高压灭菌20min，分装到1.5mLDEPC处理过的离心管。A.5PBS缓冲液A.5.1A液（0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液）NaH2PO4·H2O27.6g先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至1000mL。A.5.2B液（0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液）Na2HPO4·7H2O53.6g，（或Na2HPO4·12H2O71.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g）先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至1000mL。A.5.30.01mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液的配制A液14mL，B液36mL，加氯化钠（NaCl）8.5g，最后用蒸馏水稀释至1000mL。DB13/T5345—20216BB附录B（规范性）引物B.1表B.1规定了引物的浓度和序列。表B.1引物的浓度和序列引物名称引物浓度序列（5'-3'）PRRSV-decF10μmol/LCAAATAACAACGGCAAGCAGPRRSV-decR10μmol/LGCGTAGGCAAACTAAACTCCAPCV2-decF10μmol/LCGGATATTGTATTCCTGGTCGPCV2-decR10μmol/LGCGGTGATGATGAGATTDB13/T5345—20217CC附录C（规范性）猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型PCR产物电泳图说明：M——DNA分子量标准（100bp）；1——猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型双阳性对照；2——猪繁殖与呼吸综合征阳性对照；3——猪圆环病毒2型阳性对照；4——阴性对照。图C.1猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型PCR产物电泳图_________________________________M1234bp250500