3、医疗器械的无菌和初始污染菌检验

医疗器械无菌和初始污染菌检验技术国家食品药品监督管理局北京医疗器械质量监督检验中心医疗器械无菌检验技术什么是无菌检查法？用于检查要求无菌的医疗器械是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。无菌试验的目的：将医疗器械或其浸提液接种于培养基内，以检验供试品是否有细菌和真菌污染。医疗器械无菌检验标准GB/T14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法2010年版《中国药典》无菌检查法医疗器械无菌试验检查要点指南（2010版）无菌检验是无菌医疗器械产品生产控制过程中的一项重要内容。其检验方法、检验结果判定及检验人员业务能力等因素直接影响产品的质量和安全。作为无菌医疗器械生产企业，其无菌检验工作应由本企业独立完成。并要求企业的检验人员能当场操作或口述无菌检验的过程。灭菌:杀灭或除去特定环境或物品中一切微生物的过程。目前国际上规定，灭菌过程必须使灭菌物品污染的微生物存活率减少到10-6及以下。微生物:必须用光学显微镜或电子显微镜才能观察到的微小生物。微生物具有一定的形态与结构,并能在适宜的环境中迅速地生长和繁殖,如细菌、病毒、真菌等。无菌：是指某一物体或某一环境中不含有活的微生物。无菌技术:是指在微生物试验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施，其中包括无菌环境设施、无菌试验器材以及无菌操作。无菌操作:是指在无菌环境条件下，在对无菌制品或无菌器械进行检验的过程中，能防止微生物污染与干扰的一种常规操作方法。培养条件：用于促进微生物发育、生长和繁殖的生长培养基和培养方式的组合。抑细菌/抑霉菌试验：用选定的微生物来演示某些物质的存在能够抑制这些微生物的繁殖。培养基:是人工配制的生物营养物质，即用人工的方法将多种物质按各种微生物生长繁殖的需要配成的一种混合营养物。促生长试验：用于证明生长培养基能够支持微生物生长的技术操作。假阴性：实际阳性的无菌试验结果被变成了阴性。假阳性：实际阴性的无菌试验结果被变成了阳性。需氧菌：在代谢中，有氧条件下才能生存的微生物。厌氧菌：在代谢中，没有氧的条件下才能生存的微生物。无菌保证水平（SAL）:灭菌后产品上存在单个活微生物的概率。细菌：为单细胞微生物,其细胞分化不完善，无完整细胞核及核膜、核仁，直径一般为1μm~10μm。真菌：为多细胞或单细胞微生物，其细胞分化完善，有细胞核和各种细胞器，故易在体外生长繁殖，直径一般为10μm~100μm。医疗器械无菌检验所需设备超净工作台医疗器械无菌检验所需设备恒温培养箱（至少2台）医疗器械无菌检验所需设备压力蒸汽灭菌器医疗器械无菌检验所需设备电热干燥箱医疗器械无菌检验所需设备集菌仪医疗器械无菌检验所需设备生物安全柜:（从试验安全性考虑，建议阳性对照试验使用生物安全柜）医疗器械无菌检验所需设备电子天平医疗器械无菌检验所需设备光学显微镜医疗器械无菌检验所需设备过滤装置（无油真空泵、滤杯、滤头、滤瓶、微孔滤膜、夹子）无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。还应该具有高度的责任心和严谨细致的工作作风。环境及人员要求无菌检查法环境要求隔离系统无菌检查法环境要求无菌室在消毒处理完毕后，应检查空气中的菌落数。无菌检查法环境要求TSA琼脂平皿在30℃~35℃培养48h证明无菌取3只放无菌操作台或超净工作台平均位置打开上盖，暴露30min后盖好3只培养皿上生长的菌落数平均应不超过1个无菌试验过程中也应检查空气中的菌落数，方法要求同上无菌检查法试验前准备器具灭菌：与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内121℃30min，或置电热干燥箱内160℃2h。培养基：可按药典中的处方制备培养基，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2℃~25℃，一般在3周内使用。无菌检查法试验前准备配制培养基所需器具:无菌检查法试验前准备常用器具与稀释液:无菌检查法试验前准备培养基:无菌检查法试验前准备硫乙醇酸盐流体培养基:在供试品接种前,培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则,须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟）迅速冷却,只限加热一次，并应防止被污染。其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。30℃~35℃培养14天。需氧菌生长厌氧菌生长无菌检查法试验前准备100℃水浴加热无菌检查法试验前准备培养基:无菌检查法试验前准备•改良马丁培养基：23℃~28℃培养14天无菌检查法试验前准备培养基:•无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。•无菌性检查每批培养基随机不少于5支（瓶），培养14天，应无菌生长。培养基的适用性检查灵敏度检查：菌种培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)［CMCC（B）26003］铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)［CMCC（B）10104］枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)［CMCC（B）63501］生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64941]白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]培养基的适用性检查菌液制备：接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃～35℃培养18小时～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，（23～28）℃培养（24～48）小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数小于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。培养基的适用性检查菌液制备：接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，（23～28）℃培养（5～7）天，加入（3～5）mL含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含孢子数小于100cfu的孢子悬液。菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在（2～8）℃可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在（2～8）℃，在验证过的贮存期内使用。培养基的适用性检查平板划线法-斜线法：用接种环以无菌操作挑取菌悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线（3-4）条，再转动培养皿70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和第四次平行划线。培养基的适用性检查平板划线法-曲线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。培养基的适用性检查血琼脂平板上的金黄色葡萄球菌（大的金黄色菌落）在划线过程中，细胞逐渐分散，培养后可形成单个菌落。定期移植法:亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜面培养基上，最适条件下培养，完成培养于(4～6)℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的一种短期菌种保藏方法。操作步骤：斜面制备接种培养保藏培养基的适用性检查接种培养基应符合无菌性检查及灵敏度检查的要求。检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。灵敏度检查所用菌种（药典2010版规定）金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉分别接种各菌种新鲜培养物至相应培养基中培养，将培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成菌悬液（浓度小于100cfu/mL）硫乙醇酸盐流体培养基（12mL）9支：分别接种小于100cfu的金葡、铜绿、枯草、生孢各2支，另一支不接种做空白对照，培养3天改良马丁培养基（9mL）5支：分别接种小于100cfu的白念、黑曲霉各2支，另1支不接种做空白对照，培养5天逐日观察结果：空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，则灵敏度符合规定。培养基的适用性检查对起始样品进行连续10倍稀释，将高稀释倍数的样品与冷却至适当温度的溶化琼脂培养基倒入无菌平皿后混合均匀，培养后获得单菌落。培养基表面菌落为圆形，而培养基内部菌落呈豆状或透镜状。培养基的适用性检查•无菌检验有两种方法：直接接种法、薄膜过滤法•直接接种法:将供试品或其有代表性的各部分直接投放入培养基内培养。•薄膜过滤法:含抗菌、抑菌成分的供试品会抑制某些微生物的生长繁殖,所以用常规方法检查会出现假阴性的结果,但并不等于产品中没有微生物甚至是致病性微生物。所以采用薄膜过滤法来去除供试品中可溶的抑菌性成分,把细菌等微生物截留在滤膜上,然后再经过处理培养使所含微生物生长繁殖,从而使微生物检出。方法验证试验•当建立产品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若产品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。•验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。方法验证试验菌种及菌液制备：除大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102〕外，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培养基灵敏度检查。大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌。方法验证试验与灵敏度检验所有菌种区别：大肠埃希菌代替铜绿假单胞菌。方法验证试验•取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基中，或将培养基加至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。按规定温度培养3天~5天。各试验菌同法操作。方法验证试验：薄膜过滤法方法验证所用菌种（药典2010版规定）金黄色葡萄球菌大肠埃希菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉分别接种各菌种新鲜培养物至相应培养基中培养，将培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成菌悬液（浓度小于100cfu/mL）硫乙醇酸盐流体培养基8支：分别接种小于100cfu的金葡、大肠、枯草、生孢各2支，其中1管接入每支培养基规定的供试品接种量，另1管作为对照，培养3天。改良马丁培养基4支：分别接种小于100cfu的白念、黑曲霉各2支，其中1管接入每支培养基规定的供试品接种量，另1管作为对照，培养5天。方法验证试验：直接接种法与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量，或增加培养基的用量，或使用中和剂或更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证。方法验证试验也可与供试品的无菌检查同时进行。方法验证试验：结果判断供试品数量的选择：检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加1/2的最小检验数量作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加供试品1支（或瓶）作阳性对照用。供试品的无菌检查检验量是指一次试验所用的供试品总量（g或ml）。若每支（瓶）供试品的装量按规定