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中药指纹图谱研究技术中华中医药学会中药化学分会委员周玉新内容一、中药指纹图谱技术概述二、中药指纹图谱研究指导原则三、指纹图谱研究的相似度计算四、中药指纹图谱的研究方法与思路五、中药指纹图谱研究示例演示（实验）一、中药指纹图谱技术概述（一）中药指纹图谱与中药质量（二）中药指纹图谱研究方法学（三）中药指纹图谱技术的发展指纹图谱稳定性可控性安全性有效性1.中药指纹图谱与中药安全、有效、稳定的关系（一）中药指纹图谱与中药质量2.国内中药质量评价现状植物学方法：原植物鉴定，显微鉴定等植物化学方法：理化鉴定分析化学方法：仪器分析，色谱分析等药理学方法：生物鉴定法，生物等效等分子生物学方法:DNA指纹鉴定3.国外植物药质量评价概况•标准制剂：银杏人参西洋参五味子甘草黄芪贯叶连翘•定量测定结合主成分比例•固定产地以生产质量恒定制剂•多种分析手段和方法包括药材、中间体等指纹图谱4.中药指纹图谱的意义•是全面反应中药所含内在化学成分的种类与数量，进而反映中药的质量，尤其在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确，采用中药指纹图谱的方式，将有效地表征中药质量和稳定性•有利于中药及其产品进入国际市场5.中药指纹图谱建立的原则•系统性：指纹图谱所反映的化学成分，应包括中药有效部位所含大部成分的种类，或指标成分的全部•特征性：指纹图谱中反映的化学成分信息（具体表现为保留时间或位移值）是具有高度选择性的，是这些信息的综合结果•稳定性：指纹图谱在规定的方法与条件下应能作出相对一致的指纹图谱色谱特征的稳定性：特征峰特征区特征参数色谱条件稳定性：不同仪器的验证不同实验室的验证不同操作者的验证☆品种鉴别--真伪☆基源鉴别--产地☆药用部位的鉴别--根、茎、叶、花、果☆提取工艺☆药材炮制☆限量成分的控制☆一致性--不同批次的产品.6.指纹图谱研究目的•品种多、产地多;采收、加工不一致－化学组分与含量不同（产品品质优劣不同）•有效组分种类繁多、含量相对少；非有效组分成分复杂、含量高－分析检测困难（质量控制指标不统一）•基础研究薄弱•药材GAP建设滞后7.建立中药指纹谱所面临的问题8.对策•加强GAP药材种植基地建设•加强中药种植与加工、炮制的规范化•加强中药化学成分的基础研究•应用现代分析技术手段进行中药指纹图谱研究•仪器设备•技术人员•研究经验系统性问题稳定性问题特征性问题9.中药指纹谱研究过程中面临的问题色谱法1.液相色谱法（LC）2.气相色谱法（GC）3.薄层扫描法（TLC）4.毛细管电泳法（CE）其它1.质谱法（MS）及色谱与质谱联用2.X-衍射法3.近红外法（NIR）等（二）中药指纹图谱研究方法学（三）中药指纹图谱技术的发展•应用范围•仪器设备与软件•指纹图谱标准二、中药指纹图谱研究指导原则（一）目的和要求（二）中药指纹图谱标准起草说明（三）中药指纹图谱标准的建立•中药质量研究和质量标准的一个重要内容•加强中药质量管理、提高中药质量、保证药品安全、有效、稳定、可控•固定原料药（中药材）品种、产地和采收季节的前提下，需制定原料药(中药材)和注射剂的指纹图谱（一）目的和要求（二）中药指纹图谱标准起草说明1.名称、汉语拼音2.来源（产地、采收期、炮制）按中药的命名原则制定药材：产地、采收期、炮制中间体：提取工艺或提取物的来源3.供试品溶液的制备有效成分(专属性成分、指标性成分)的理化性投质并结合检测方法的要求提取工艺4.参照物溶液的制备对照品内标物标准提取物5.中药指纹图谱检测方法的验证（1）检测方法测定方法、仪器、试剂、测定条件（2）验证专属性（空白试验）精密度试验（RSD3%）重复性与重现性试验（S0.95）稳定性试验（S0.95）系统适应性试验6.指纹图谱的相关性（三）中药指纹图谱标准的建立1.注意事项（1）所有成分应在2小时左右洗脱，并提供2小时的指纹图谱（2）可建立各个组分的指纹图谱（3）可建立多种方法的指纹图谱（4）可选择典型样品的指纹图谱，或标准提取物的指纹图谱，或具有代表性的勾兑样品的指纹图谱作为标准指纹图谱2.指纹图谱标准的建立（1）药材、中间体指纹图谱标准为企业内控标准，列入起草说明（2）10批供试品（3）标准的规定：供试品的指纹图谱与对照提取物（标准提取物的指纹图谱一致；或供试品的指纹图谱与对照指纹图谱（标准图谱）一致；或通过对各特征峰的位置（相对保留时间、比移值等）、丰度（积分面积或峰高）及相对丰度、光谱特性（颜色）等综合参数的描述予以确定。3.指纹图谱标准书写格式液相色谱法【指纹图谱】照高效液色谱法（中国药典一部附录VID），结合指纹图谱的要求测定。色谱条件及系统适用性试验如以对照品做系统适用性试验，则参照中国药典书写格式。如以随行对照提取物做系统适用性试验，则只书写所用仪器、色谱柱型号及有关参数和各项具体试验条件。对照品溶液的制备如有对照品则照中国药典书写格式。供试品溶液的制备精密吸取供试品溶液、对照品溶液（或对照用提取物溶液）各XXml，分别流入液相色谱仪，测定。本品指纹图谱的主要特征供试品指纹图谱与质量标准所附的对照指纹图谱（或随行对照提取物指纹图谱）经计算软件计算，相似度大于XX，符合要求（或相似度小于XX，不符合要求）。三、指纹图谱研究的相似度计算（一）、指纹图谱相似度评价原则与方法（二）、指纹图谱相似度计算原理（三）、指纹图谱相似度评价软件（一）、指纹图谱相似度评价原则与方法原则：整体性、模糊性、特征性方法：直接观察、计算机辅助相似性计算1.引用参数2.数据获取途径3.相似度算法（二）、指纹图谱相似度计算原理1.引用参数①保留时间(RT)②峰高(Height)③峰面积(Area)④峰面积百分比（Area%）⑤相对保留时间（RatioofRetentionTime,RRt）⑥积分相对比值（RatioofArea,RA）2.数据获取途径（1）图形/图像转化成ASCII数据（2）截片数据（3）色谱数据3.相似度算法夹角余弦算法相关系数算法优化算法1.软件开发原则2.市售/常用软件简介3.相似度软件使用过程中应注意的问题（三）、指纹图谱相似度评价软件1.软件开发原则(1)系统独立性(2)计算方法的科学性(3)数据接口通用性(4)操作过程及应用的实用性2.市售/常用软件简介(1)浙江大学陈一宇教授(2)中南大学梁逸增教授(3)沈阳药科大学毕开顺教授(4)西北大学李华教授(5)二军大(6)Waters3.相似度软件使用过程中应注意的问题(1)数据接口与数据类型(2)数据的校正(3)算法的选择四、中药指纹图谱的研究方法与思路（一）、研究方案设计（二）、样品的选择与收集（三）、供试品的制备（四）、指纹图谱色谱条件研究的思路（五）、相似度值的研究与指纹特征（一）、研究方案设计1.资料收集与整理文献、工艺资料、质量标准2.方案的设计（1）研究对象-有效成分（2）研究方法的选择-色谱法(HPLCGCTLC)及其它方法（3）研究内容-根据技术要求的规定：包括“名称、来源、制备、检测方法、标准规定及起草说明”（二）、样品的选择与收集要求：10个批次道地药材与GAP基地药材典型性与代表性离散样品的剔除（三）、供试品的制备依据：有效组分的物理化学性质生产或提取工艺检测方法的需要（四）、指纹图谱色谱条件研究的思路1.高效液相色谱法HPLC2.气相色谱法GC（1）检测波长的选择（简）（2）柱温的选择（略）（3）进样量（简）（4）色谱柱的选择（重点）（5）检测成分的选择（重点）（6）流动相（梯度表）的选择（重点）1.高效液相色谱法HPLC示例：蜂胶(BeePropolis)（1）检测波长的选择min10203040506070mAU0200400600800100012001400*DAD1,Sig=280.00,2.00Ref=off,EXTofHC012201.D=280nmmin10203040506070mAU0100200300400500*DAD1,Sig=360.00,2.00Ref=off,EXTofHC012201.D=360nmmin10203040506070mAU0100200300400500600700*DAD1,Sig=254.00,2.00Ref=off,EXTofHC012201.Dmin10203040506070mAU-2500-2000-1500-1000-5000*DAD1,Sig=210.00,2.00Ref=off,EXTofHC012201.D=254nm=210nmmin10203040506070mAU0200400600800100012001400*DAD1,Sig=280.00,2.00Ref=off,EXTofHC012201.D波长选择：=280nm（4）色谱柱的选择选用市场上较常见的填料所填充的色谱柱，例如：Eka-Nobel的KromasiC18(5mm)，其分离效果好、性能稳定，无论是国产填充的Kromasi色谱柱，还是国外公司填充的Kromasi色谱柱，在分离效果上基本相同。因此对于大多数中药注射剂，可选用Kromasi色谱柱。如选用乙腈-缓冲溶液，应根据缓冲溶液的特点，选用相应的色谱柱：①如为酸性缓冲溶液，可选用ZorbaxSB-C18色谱柱（pH2）；②如为碱性缓冲溶液，可选用EclipseXDB-C18色谱柱（pH6）。示例：不同的色谱柱对三七总皂苷的分离效果min010203040506070mAU0100200300400500600VWD1A,Wavelength=203nm(SANQI\A2112501.D)LichosorbLichosorbmin0102030405060mAU0100200300400500VWD1A,Wavelength=203nm(SANQI\A2112502.D)PolarisPolarismin010203040506070mAU0100200300400500600700VWD1A,Wavelength=203nm(SANQI\A2112500.D)KromasilKromasilmin0102030405060mAU0100200300400500600700800VWD1A,Wavelength=203nm(SANQI\A2112503.D)DiamonsilDiamonsilmin01020304050mAU0100200300400500600VWD1A,Wavelength=203nm(SANQI\A2112504.D)CarbosorbODS-3Carbosorbmin010203040506070mAU020406080100120140*VWD1A,Wavelength=203nm(SANQI\A2112503.D)*VWD1A,Wavelength=203nm(SANQI\A2112500.D)*VWD1A,Wavelength=203nm(SANQI\A2112502.D)（5）检测成分的选择（重点）示例：何首乌min01020304050mAU05001000150020002500VWD1A,Wavelength=296nm(HSWFP\A3091301.D)2.1432.3332.6992.8284.14110.60811.12711.84712.17912.63112.89713.06913.40213.92214.20714.52214.68514.86915.09415.55315.92516.34316.76116.94617.21017.66218.13118.53918.88419.34819.54019.81620.21420.61221.16221.56022.33322.91723.26623.50523.88824.09824.42324.77025.26525.83426.55726.97427.12327.50328.27928.92029.20129.45930.11031.02531.39035.20246.83150.94951.696何首乌生品