微环境的保持对体外授精后胚胎培养的影响：

辅助生殖微环境的保持对体外授精后胚胎培养的影响：掀盖式迷你培养箱和传统前开门式培养箱的对比摘要目的：研究胚胎培养时保持微环境的作用和使用两类培养箱的临床结果。方法：在开/关迷你培养箱和传统培养箱门5秒后,我们进行两箱内温度和氧气浓度的对比。将30个IVF-ET的胚胎随机放进这两个培养箱中进行培养，将生成的早期优质胚胎率和优质囊胚率进行对比，从而衡量它们微环境保持的能力。结果：开/关门5秒后，迷你培养箱大约需要5分钟来恢复箱内的温度，而传统培养箱需要30分钟。迷你培养箱（3.0±0分钟）比传统培养箱（7.8±0.9分钟）内氧气浓度的恢复明显得到了改善。迷你培养箱的早期优质胚胎和优质囊胚的生成率(39.5%和15.1%)比传统培养箱(28.4%和7.8%)明显要高。结论：培养箱中微环境的保持能力对优质胚胎的生成有显著的影响。介绍：我们认为IVF-ET结果改进的原因之一是由于胚胎培养所需的行业上使用的标准产品。对于培养液，虽然我们对比了许多培养液的有效性，但并没有发现很大的区别。标准的培养微环境一般设为：温度37℃，5%的O2，5%的CO2和90%的N2。同样，要保持一个最优的环境，要注意胚胎培养时各种加热器的使用方法并依据培养液的实际温度要对培养箱温度进行调整，从而对温度进行更准确的控制。研究中，我们对比了两种培养箱在保持微环境能力上对胚胎培养结果的作用：一种是掀盖式迷你培养箱(K-MINC-1000,COOK,Co.,Australia)，它对温度和气体浓度有好的保持能力；另一种是水套加热系统的传统前开门式培养箱（混合气体CO2培养箱，APM-30D，ASTEC，CoJapan）材料和方法：胚胎培养时微环境保持能力的评估小腔、掀盖式的迷你培养箱(K-MINC-1000,COOK,Co.,Australia)用于采用培养皿的胚胎培养。培养皿的上下都装有加热器这样就可以直接对培养皿进行加热。这种掀盖式的盛放四孔培养皿的培养箱最多能容纳8个培养皿（图1A）。然而，研究中使用的传统的前开门式培养箱(混合气体CO2培养箱,APM-30D,ASTEC,Co.Japan)最多可以容纳48个培养皿(60mmPetri盘)，由于前开门式培养箱的内腔相对较大，它可以为每个患者提供了更多的存储空间，但它是利用水套系统加热内腔的且需要一定时间来恢复腔内的气体浓度（图1B）。1北京微创辅助生殖图1：掀盖式迷你培养箱和传统的前开门式培养箱的照片（A）掀盖式迷你培养箱（Ｂ）传统的前开门式培养箱研究中，我们结合定时打开这两类培养箱来研究、对比它们对微环境保持的能力。假定平均开门时间为5秒，我们记录关门（在持续开门5秒钟后）到氧气浓度恢复到标准水平时所需的时间。培养箱的标准温度设为37℃而实验室内温度设为25℃。电热调节器温度计用来测量培养箱腔内和培养皿内的温度，培养箱内气体显示器测量氧气的浓度。重复此操作10次，将它们的平均数作为最终结果。胚胎培养结果的评估：从2005年7月到2006年4月期间，我们学院为30个接受治疗的不育患者（平均年龄34.8岁）每人至少采集了8个卵母细胞。平均为每位患者采集到17.4个卵母细胞，采集卵母细胞后，使用通用培养液(MediCult,Co.,Denmark)进行授精。用传统培养箱对授精卵进行17小时培养后，确定胚胎处于2-PN期，将每个患者的胚胎随机放进这两个培养箱中的任意一个内，并使用商品化培养液(BlastAssistSystemmediumTM;MediCult,Co.,Denmark)进行培养，然后，对比早期优质胚胎和优质囊胚的生成率。胚胎培养是开放式的（每个胚胎单独在0.5ml培养液中培养），一个培养孔里培养一个胚胎，然后观察每个胚胎的发育。Bolton分类法用来定义早期优质胚胎，是指胚胎（属于Ⅲ级或更高级）在第2天成长为4细胞体并在第三天成长为8细胞体。Gardner分类法用来定义优质囊胚，是指在第5天属于3AB或更高级别的囊胚（图2）。图２：优质胚胎和囊胚：（Ａ）早期胚胎，４细胞体，Ⅲ级；（Ｂ）早期胚胎，８细胞体，Ⅲ级；（Ｃ）囊胚，３ＡＢ数据分析：以组间平均标准差表示的值来通过K-S双样本检验或卡方检验来进行统计分析，我们认为P值小于0.05有统计意义。2北京微创辅助生殖结果：掀盖式迷你培养箱开门5秒钟后，大约需要5分钟能恢复腔内和培养皿里的温度（36.9-37.0℃）（图3）温度（℃）３７．０２３７．００３６．９８３６．９６３６．９４培养皿里３６．９２培养箱里３６．９０３６．８８３６．８６３６．８４０１２３４５６（分）图３：掀盖式迷你培养箱温度的改变（开门５秒钟后）使用传统前开门式培养箱，开门5秒后，大约需要20分钟能恢复腔内温度。腔内温度在恢复到37℃前会很快下降到36.4℃，但是培养皿里温度的下降是逐步的，在关门10分钟后能到达最低36.7℃，且大约需要30分钟才能恢复到37℃。（图4）温度（℃）３７．１０３７．００３６．９０３６．８０３６．７０３６．６０３６．５０３６．４００５１０１５２０２５３０３５４０（分）图４：传统的前开门式培养箱温度的改变（开门５秒钟后）与传统培养箱(7.8±0.9分钟)相比，迷你培养箱(3.0±0分钟)只需更短的时间就能恢复氧气浓度。（表1）表１：微环境恢复的对比掀盖式迷你培养箱传统的前开门式培养箱温度4.9±0.5分31.5±2.9分氧气3.0±0分7.8±0.9分备注：开门５秒后恢复需要的时间，Ｐ0.01(迷你培养箱和传统培养箱的对比)培养箱培养后，迷你培养箱的早期优质胚胎生成率（190个授精胚胎中有75个，39.5%）比传统培养箱(在158个授精胚胎中有42个，28.4%)明显要高迷你培养箱优质囊胚的生成率（166个授精胚胎3北京微创辅助生殖中有25个，15.1%）也明显高于传统培养箱（139个授精胚胎中有10个，7.8%）。（表2）表２：胚胎和囊胚生成率掀盖式迷你培养箱传统的前开门式培养箱早期优质胚胎生成率（％）（优质胚胎/受精卵）40.3∗(75/186)28.4(42/148)囊胚生成率（%）（优质囊胚／所有胚胎）15.1∗(25/166)7.2(10/139)Ｐ0.0５(迷你培养箱和传统培养箱的对比)因为我们使用了每个患者的多个卵母细胞，所以不能进行妊娠率的评估，本试验项目中最终的总体妊娠率为37.8%。讨论：在开/关门后，迷你培养箱内环境的恢复能力比传统培养箱要强，体现在温度的保持能力上有很大的不同。维持胚胎培养温度的重要因素中，除了培养箱类型外，还包括在授精时恒温平台的使用、培养液的剂量和培养皿的使用。由于大量培养液的使用，我们学院使用的开放式培养--在控制合适的温度上--比微滴培养好。考虑温度保持和恢复的重要性，我们用保持温度的能力来评价开放式培养的好处。我们了解微滴培养的好处并且由于成本效率的原因，我们预测微滴培养会在将来更多的被使用。我们评估开放式培养的另外一个原因是我们已经积累了使用开放式培养得到的临床数据。传统培养箱内温度(降到36.4℃)相对大幅度降低的原因很可能是由于开门导致的大量空气流动，这是由于为了重新恢复气体浓度，需要从气缸注入冷气体造成的。培养皿里温度的恢复比腔内的温度恢复要慢，研究中，最大的温差有0.6℃，但在日常的操作中，温差可能会比这个数据大，下降了的温度会持续比我们的实验更长的时间恢复，这是由于为了观察胚胎和置换培养液，我们开关门的次数更加频繁。当有很多患者或从某个患者身上采集到很多卵母细胞时，培养箱里微环境的保持对培养结果是有影响的。我们的临床结果显示:使用掀盖式迷你培养箱,优质胚胎的生成率明显更高。要进行进一步分析,我们需要对更多的病例进行研究，然而在一定时期内我们的患者是有限的。我们研究的一个优点是：由于我们将同一患者的多个胚胎随机放进这两个培养箱中，在胚胎培养环境对比时就能减少偏差，我们希望这能解释研究的各种限制和参数。而且，我们不以囊胚生成率而是以优质胚胎的生成率作为胚胎微环境的比较计，从这方面来说，我们研究与其他相似研究的目的不同。据报道，虽然对比研究方案和患者情况不相同，但是迷你培养箱能提供更高的妊娠率和更低的IVF-ET后流产率。在体外授精的评估中，特别是评定妊娠率时，很难排除患者本身的偏差。虽然我们不是为了评估妊娠率而设计的研究，但是我们相信对同一个患者的胚胎随机分配对降低这种偏差是有用的。大的培养舱是利用水套系统加热的，我们认为它比气套系统能更好的保持腔内温度，而气套系统能更快的恢复各种参数。关于CO2浓度和PH水平，有大培养舱的培养箱有一个TC传感器，它也能显示CO2浓度（同时测量）。然而，在我们研究中没有对CO2进行分析。CO2浓度并不会因为开关门导致变动，这是因为周围空气中CO2的浓度很低。我们使用的迷你培养箱由于它直接输入的是混合气体，因此没有测量CO2浓度的功能。研究中，我们仅依据腔内温度恢复的时间来对比两种培养箱气体恢复的能力。结论证实培养箱内微环境的保持能力会影响优质胚胎的生成率，要改善微环境可以通过更换培养设备轻松实现。4北京微创