环境酸度对紫花苜蓿早期生长和生理的影响

书书书环境酸度对紫花苜蓿早期生长和生理的影响李剑峰１，２，师尚礼１，２，张淑卿１，２（１．甘肃农业大学草业学院，甘肃兰州７３００７０；２．草业生态系统教育部重点实验室中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃兰州７３００７０）摘要：采用沙培的方式研究酸性土壤中土壤酸度对紫花苜蓿生理和生长的影响。结果表明，ｐＨ值在５～６的弱酸性环境为苜蓿的最适生长环境，这一酸度范围内幼苗生长正常或受到促进，如单株叶片数高于对照（ｐＨ＝７）处理２３．６％～２７．２％、单叶面积高出对照２０．８７％～２５．５０％，叶绿素含量高出对照３１．２％～２７．９％，差异均达显著水平（犘＜０．０５）。而出苗率、株高、根瘤数、根瘤等级、根长和地上、地下生物量亦高于对照；而ｐＨ值低于４的环境酸度为低适生长环境，可使苜蓿幼苗受到严重胁迫，出苗率、株高、单叶面积、单株叶片数、根瘤数、根长和地上、地下生物量均低于其他处理。在不同土壤酸度下，质膜透性、叶绿素含量、光化学效率（Ｆｖ／Ｆｏ）等均存着显著差异（犘＜０．０５），ｐＨ＜４的各项生理指标均明显低于ｐＨ≥５的处理，其中地上生物量和根系活力分别不足对照处理的５５．６％和６１．１％（犘＜０．０５）。关键词：紫花苜蓿；酸性环境；ｐＨ值；生长中图分类号：Ｓ５５１．７０１；Ｑ９４５．７　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１０）０２００４７０８　土壤的酸化是一个持续不断的自然过程，土壤中动植物呼吸作用产生的ＣＯ２溶于水形成Ｈ２ＣＯ３，土壤中动植物残体经微生物分解产生有机酸等都使土壤有酸化的趋势，而酸雨也是促进土壤酸化的人为因素之一。所谓的酸性土壤是指过滤和吸收了有能力释放Ｈ＋的酸性物质，即ｐＨ值低于７的土壤。但对于农业生产来说，耕作层土壤ｐＨ值低于６．６即为酸性土壤。紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）是一种优良的豆科牧草，具有产量高、持久性好、饲用价值高、用途广等众多优点，在世界各地的畜牧业中发挥着非常重要的作用［１］，２０世纪９０年代中期以来，应农业结构调整、畜牧业发展的需要及国家退耕还草政策的要求，苜蓿产业逐步发展成为我国农业领域新兴产业，在范围上已经分布到除南方几个省市以外的所有地区，这主要是通常认为紫花苜蓿不适宜在酸性土壤种植所致［２］。我国广阔的红壤区域普遍偏酸性（ｐＨ＜５．０），甚至呈强酸性（ｐＨ＜４．５），因此限制了紫花苜蓿在我国许多省份的种植［３］。但近年的研究表明，部分半秋眠和非秋眠紫花苜蓿品种在酸性土壤中亦可正常生长［４］。宫家臖等［５］用沙培的方法研究了酸性土壤含铝量与紫花苜蓿生长的关系，发现在ｐＨ为４．５的酸性环境下，１００ｍｇ／ｋｇ以上的土壤含铝量能使苜蓿的生长受到严重抑制，而低于５０ｍｇ／ｋｇ的土壤含铝量下植株生长较好，这说明酸性土壤对紫花苜蓿生长的抑制除酸性本身以外还有其他的因素存在。Ｍｅｓｆｉｎｔ和Ｄｅｂｏｒａｈｌ［６］认为铁和铝的溶解度在酸性环境下极大，苜蓿在大量吸收了这２种元素后限制了根的生长，降低了根吸收水分和所需营养物质的能力，从而使植株无法进行正常的代谢，而在中性或碱性土壤中铁和铝的溶解度低，不足以毒害植物。Ｊｏｓｈ［７］的研究也认为，限制植物生长的因素不是氢离子的活动，而是铝和锰元素的毒害作用限制了植物的生长，同时造成营养元素的缺乏。而Ｓｔｏｕｔｄ［８］认为，在土壤ｐＨ值高于５．５的酸性土壤中，苜蓿的产量低是由于共生细菌的固氮能力降低导致土壤中氮素的缺乏引起的。但关于高浓度的Ｈ＋对苜蓿生长的抑制和毒害，目前很少有人进行相关的具体研究，并且与酸胁迫相关的研究也以在代表性酸性土壤下栽培［６８］，模拟实际生产中遇到的酸、铁、铝等多重胁迫为主，很少具体的探究环境酸度对植株的单独影响。本试验旨在研究不同酸度环境对紫花苜蓿生长和生理的影响，为紫花苜蓿在酸性土壤中的推广种植和紫花苜蓿耐酸胁迫的进一步研究提供依据。第１９卷　第２期Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．２草　业　学　报ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　４７－５４２０１０年４月收稿日期：２００９０２２７；改回日期：２００９０３１６基金项目：国家科技部“西北优势和特色牧草生产加工关键技术研究与示范”（２００７ＢＡＤ５２Ｂ０６），“奶牛优质饲草生产技术研究及开发”（２００６ＢＡＤ０４Ａ０４），“优质抗逆专用草新品种选育”（２００６ＢＡＤ０１Ａ１９），农业部行业专项“人工草地优质牧草生产技术研究与示范”（ｎｙｈｙｚｘ０７０２２）和现代农业产业技术体系建设专项资金资助。作者简介：李剑峰（１９７９），男，甘肃天水人，博士。Ｅｍａｉｌ：[e-mail]通讯作者。Ｅｍａｉｌ：[e-mail]１　材料与方法１．１　试验材料和方法１．１．１　供试材料　供试苜蓿品种为中种草业公司提供的ＷＬ５２５，种子用０．１％ＨｇＣｌ消毒１０ｍｉｎ，并用去离子水冲洗干净后播种。１．１．２　Ｈｏｇｌａｎｄ营养液的制备　大量元素：Ｃａ（ＮＯ３）２１４１７ｍｇ／Ｌ；ＫＮＯ３６０７ｍｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ４４９３ｍｇ／Ｌ；（ＮＨ４）３ＰＯ４１１５ｍｇ／Ｌ；铁素：ＦｅＳＯ４·４Ｈ２Ｏ２８ｍｇ／Ｌ；微量元素：Ｈ３ＢＯ３２．８６ｍｇ／Ｌ；ＭｎＣｌ２·４Ｈ２Ｏ１．８１ｍｇ／Ｌ；ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．２２ｍｇ／Ｌ；ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ０．０８ｍｇ／Ｌ；Ｈ２ＭｏＯ４·Ｈ２Ｏ０．０２ｍｇ／Ｌ。营养液以去离子水稀释至１／４浓度后用ＮａＯＨ（１ｍｏｌ／Ｌ）或ＨＣｌ（１ｍｏｌ／Ｌ）调节ｐＨ值至所需酸度。１．１．３　试验设计　试验于２００７年进行，采用细沙作为栽培基质，经ＨＣｌ浸泡后用去离子水清洗烘干备用。在直径９ｃｍ，深７ｃｍ，容积为６００ｍＬ的塑料花盆内铺设与底面形状一致的无纺布，盆内装入３００ｇ干燥细沙并将沙面平整，用镊子挑选２０粒大小一致的饱满种子均匀摆放细沙表面，覆盖干沙５０ｇ。分别设ｐＨ为２，３，４，５，６和７，６个环境酸度处理；所有处理设６个重复。将各处理塑料盆置入盛有相应ｐＨ值的１／４Ｈｏｇｌａｎｄ营养液的水槽中，使营养液能缓慢由底部渗入，并在盆内形成高于沙表面３～５ｍｍ的液面，然后用Ｈａｈａ８２１０型便携式ｐＨ计伸入液面以下测定ｐＨ值，直至液面ｐＨ值达到处理酸度±０．１时将盆取出。每４ｄ用相应ｐＨ值的Ｈｏｇｌａｎｄ营养液重复处理１次。４５ｄ后测定生理数据及生物量、根长、根瘤数量。并以５分制计分法［９］对根瘤评分，１分为最差，５分为最好。５分值计分法评价根瘤。１分：根瘤为中空无内容物的死亡根瘤；２分：根瘤为切面灰白色的无效根瘤；３分：根瘤切面略呈粉红色，但直径小于＜０．５ｍｍ；４分：根瘤切面呈粉红色，１ｍｍ＞直径≥０．５ｍｍ；５分：根瘤切面呈粉红色，直径≥１ｍｍ。１．２　测定指标和方法１．２．１　出苗率、生物量、根瘤数的比较　播种后每天记录各处理的出苗数，计算出苗率；每处理盆栽随机标记３株幼苗用于测量株高、叶片数、以描形称重法于出苗４５ｄ时测定每标记植株自株顶向下第６叶的单叶叶面积［１０］；出苗４５ｄ时，将栽培基质和苜蓿苗从盆中整体取出用水冲洗，直至全株完全冲洗干净，然后取出标记植株，测定其根系长度、根瘤数目、根瘤等级、单株地上生物量和地下生物量。１．２．２　细胞膜透性的测定　参照刘慧霞和王彦荣［１１］及孙铁军和苏日古嘎［１２］的方法以叶片相对电导率反映细胞膜透性的大小，称取苜蓿叶片０．２ｇ，置入盛有去离子水的试管中，真空泵中抽气３０ｍｉｎ使叶片浸没于水。静置２０ｍｉｎ后，用ＤＤＳ３２０型电导仪测定溶液电导率。再放入沸水浴中加热３０ｍｉｎ，冷却至室温后测定其煮沸电导率。重复３次取其平均值。用公式计算其相对电导率：相对电导率（％）＝处理后叶片电导率×１００／煮沸电导率。１．２．３　植株根系活力的测定　将０．１５ｇ新鲜根系浸没于含０．２％ＴＴＣ（氯化三苯基四氮唑）的６６．７ｍｍｏｌ／Ｌ的磷酸缓冲液，避光３７℃保温１ｈ后加入１ｍｏｌ／Ｌ的硫酸终止反应。取出根研磨后用乙酸乙酯反复提取红色的ＴＴＣ还原产物三苯甲僭（ＴＴＦ），４８５ｎｍ波长下测定提取液的ＯＤ值。根据标准曲线计算ＴＴＣ还原量［１３］，以单位时间内单位鲜根还原ＴＴＣ的量（μｇ／ｇＦＷ·ｈ）表示根系还原力，以此反映植株的根系活力。１．２．４　叶片色素含量的测定　采用吸光度法，称取０．５ｇ新鲜叶片，加８０％的丙酮研磨提取后在波长６６５和６４５ｎｍ处测定光密度，并计算叶绿素含量（ｍｇ／ｇ）。１．２．５　叶绿素荧光特性的测定　用ＦＭＳ２型便携式调制荧光分析仪（Ｈａｎｓａｔｅｃｈ公司）进行叶绿素荧光动力学参数测定［１４］。测定前将叶片暗适应３０ｍｉｎ后测定Ｆｏ（初始荧光）、Ｆｍ（最大荧光）、Ｆｖ（可变荧光），计算Ｆｖ／Ｆｍ（叶片ＰＳⅡ原初光能转化效率）和Ｆｖ／Ｆｏ（ＰＳⅡ潜在活性）。１．３　数据分析采用ＤＰＳ３．０专业统计分析软件进行数据分析和差异显著性检验。２　结果与分析２．１　环境酸度对苜蓿出苗率和存活率的影响不同的酸度处理（简称酸度，下同）对苜蓿种子出苗率和成活率的影响有较大差异（表１），处理１４ｄ后弱酸组８４ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０）Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．２（ｐＨ≥５，且ｐＨ＜７）的发芽率略高于对照（ｐＨ＝７，下同），而中强酸处理组（ｐＨ≤４）发芽率显著低于对照和弱酸处理组１３３．５３％～２９．１１％（犘＜０．０５，下同）；出苗４５ｄ后，ｐＨ≥４的酸度下植株成活率与对照差异不显著，ｐＨ≤３的处理的成活率均显著低于对照，其中ｐＨ＝２的酸处理下所有植株在出苗１９ｄ后全部死亡。（因此本试验４５ｄ后的数据无ｐＨ＝２的处理）；种子发芽率与环境ｐＨ值呈显著的单峰曲线变化，相关系数狉达０．９７２，（显著相关，极显著相关），而存活率在ｐＨ≥４的环境下差异不大。由此可见，环境酸度对出苗率的影响显著大于植株的存活率，说明植株在出苗后在酸性环境下有所适应，具备了一定的耐受能力。环境弱酸处理组的出苗率和存活率均略高于对照，说明弱酸性环境有利于苜蓿的出苗和存活。２．２　环境酸度对苜蓿株高，叶片数和叶面积的影响环境酸度对苜蓿幼苗的生长速率有很大的影响表１　环境酸度对紫花苜蓿出苗率和存活率的影响犜犪犫犾犲１　犈犳犳犲犮狋狅犳狆犎狏犪犾狌犲狅狀狋犺犲狊狌狉狏犻狏犪犾狉犪狋犲犪狀犱犲犿犲狉犵犲狀犮犲狉犪狋犲狅犳犕．狊犪狋犻狏犪处理ｐＨ值ＴｒｅａｔｍｅｎｔｐＨｖａｌｕｅ处理第１４天的出苗率Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅｒａｔｅｉｎ１４ｄ（％）处理第４５天的植株存活率Ｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅａｆｔｅｒ４５ｄ（％）７８５．７３±２．６８ａ８５．５２±２．０９ａ６８６．６７±２．６４ａ９３．８０±２．３６ａ５８８．３３±１．７５ａ８８．０６±５．７７ａ４６６．４０±２．３６ｂ９０．００±２．５０ａ３５８．０９±２．８９ｂ４５．８４±１．１７ｂ２３６．７１±３．４２ｃ０ｃ　不同字母表明处理间差异显著（犘＜０．０５，ＬＳＤ法）；ｐＨ＝２的处理因出苗１９ｄ时已全部死亡，故１９ｄ之后无该处理的数据。下同。　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｔ犘＜０．０５ｌｅｖｅｌｂｙＬＳＤｍｅｔｈｏｄ；ＢｅｃａｕｓｅｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｐＨ＝２ｗｅｒｅｄｅａｄ；ｔｈｅｒｅｎｏｄａｔａｃａｎｂｅｕｓｅｄ．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．（图１），在试验期间ｐＨ＝５的植株生长最快，在１５ｄ后显著高于其他处理（犘＜０．０５），但在２９～４０ｄ与ｐＨ低于５的其他处理一样生长变缓。ｐＨ为４和６两处理间的植株在２９ｄ内高度差异不明显，但在２９～４０ｄｐＨ＝６的处理高度增长量显著高于其他处理，且生长速率明显快于对照；ｐＨ≤３的处理在１５ｄ内虽生长较为缓慢，仍分别达到对照的７０．４％和７４．８％，但在出苗１５～４０ｄ则基本停止生长，甚至枯死。这一结果说明植株受到酸胁迫的影响是一个持续的积累过程。环境ｐＨ值为５和６的处理单株叶片数最多，并在出苗４０ｄ时显著高于其他处理，分别高出对照２３．６％和２７．２％（图２）；在出苗１５ｄ时各处理间叶片数目差