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精子的低温贮藏：是否存在交叉污染的潜在危险？GaryN.ClarkeAndrologyDepartment,TheRoyalWomen'sHospital,Carlton,Victoria3053,Australia编译：北京博益伟业仪器有限公司虞海燕北京100085sales@bio-one.cn精子的低温保存一直被人们所关注，在很多科学刊物或医疗刊物上刊登了大量的文章来研究此课题。目前，体外人工受精的受孕率已经可达到自然受孕率的水平。然而，在大部分文献中，极少有人注意过在精子库保存过程中的微生物交叉污染现象。值得欣慰的是，很多精子银行的负责人逐渐意识到了这一严重现象，针对此问题，他们制定了一系列解决方案。方案之一就是在进行低温储存精子之前，需要从众多精子提供者中筛选掉患有HIV病毒、乙肝、丙肝和梅毒的患者。另一个方案是，在把健康合格的精子存入精子库之前，而又尚未得知上述的筛选结果的情况下，需要把精子暂时存放在隔离罐中，通过筛选后，最后才把健康合格的精子样本转移到特制的储存罐中。但是这两种方案都有缺点，即无法检测到HIV病毒的潜伏期，并且此种筛选程序无法函盖所有的病原体。因此，我们迫切需要第三种方案来解决这些问题，以阻止其发生或使其可能性降到最低。在使用液氮保存生物样品的过程中，可能出现交叉污染和继发感染现象，这在以前就被证实过。核苷酸序列分析得知，在保存骨髓细胞的过程中，出现了乙肝病毒的交叉感染现象。其他病毒也被发现可存活于液氮中，包括水泡口炎病毒、单纯性疱疹病毒、腺病毒和乳头瘤病毒。这也是液氮中存在微生物污染现象的证据之一，这些微生物包括大部分细菌和真菌。在Fountain的实验室中，有一个液氮罐严重感染了一种曲霉菌，这是一类潜在病原体。他们报道，解冻的骨髓细胞样本中有1-2%污染了此种曲霉菌，这极有可能是在保存过程中通过液氮的交叉污染而发生的。因此，毫无疑问，包括乙肝病毒在内的很多微生物能够直接暴露于液氮中并存活下来，在一定条件下导致了交叉污染。在有力证实了液氮中也存在微生物污染或交叉污染的情况下，我们就必须严肃对待精子低温贮藏中的污染或交叉污染现象。传统的精子保存方案并不涉及无菌操作的问题。尤其在填充麦管时或过量填充引起麦管胀破时，都可能污染液氮。不正确密封麦管也可能吸收进被污染的液氮，从而导致各精子样本的交叉污染。此外，使用聚乙烯醇粉末密封容器时还会引起额外的交叉污染，因为聚乙烯醇粉末可引起细菌的大量繁殖并最终进入另一个麦管内部。使用冻存管保存精子时，如果直接接触液氮，也会吸进液氮引起污染，因为冻存管的盖子在低温下是无法达到100%密封的。一个丹麦的生产厂家极力宣称，给冻存管套上一个叫做Cryoflex的外壳可以提供足够的密封性，并且可以将冻存管直接投入液氮中保存。本实验室的近期研究表明，在液氮中浸泡3小时后，45%没有O型圈的冻存管和85%带有O型圈的冻存管在都吸进了液氮。与此形成鲜明对比的是，冻存管在气态液氮中贮存16-24小时后，在冻存管内部仍然不存在液氮。在某些情况下，冻存管吸进液相液氮的量居然能达到1ml！在样品长时间贮存和正确解冻之后，任何微生物都能够随着液氮的吸进与精子接触，并在液氮挥发后仍然停留在精子细胞表面。当临床应用这些精子样本进行人工受精时，就可能导致交叉污染，某些疾病如乙肝只需微量的病毒就可引发感染。由微生物引起液氮污染和冻存管吸进液氮的现象，使低温保存的精子在临床应用时出现不可避免的交叉污染问题。在临床医学的其他领域中，交叉污染是一个很严重的问题，必须采取相应措施使污染程度降到最低。幸运的是，确实有不少细节和措施可用来改进低温保存条件，在保存精子样本时可以使交叉污染的潜在危险降到最低。麦管或冻存管的封闭毫无疑问，足够的密封性是至关重要的。通过加热麦管的两端可达到封闭效果，或使用PVA粉也可以密封住麦管。通过内部棉塞吸取精子冻存液，使其接触并移到内棉塞和外棉塞之间的PVA粉中，从而达到封闭效果。在另一端需要留一个约1cm的空隙，避免冷冻时胀破，将麦管端部浸泡在水中几分钟使其变硬。法国一公司发明了一种新的麦管封闭系统（CBS），由防碎的离子交联聚合物树脂做成，样本歧管可防止麦管和精子相互接触，同时可在两端进行加热封闭，极大降低了交叉污染现象。微生物检测报告表明，在微生物容易繁殖的麦管两端，CBS麦管能达到很高的封闭性，这些检测报告是由BernardGuerin博士(LaboratoirePourLeControleDesReproducteurs,MinisteredeL'Agriculture,BP65.13,rueJouet-94703Maisons-AlfortCedex,France)来完成的。与麦管有所不同的是，冻存管在液氮条件下是无法保持其密封性的，它们必须套上一层外套如Cryoflex，或者在气相中进行样本保存，才能避免污染。气相液氮的低温保存以前的研究显示，人类的精子在–79°C时保存一年后仍然能保持其活性和受孕能力。有一个科学家报道(Sawada,1964)，使用在干冰中保存了2-315天的精子对150例女性进行230次人工授精，最后成功得到11例孕妇。研究还发现，从–79°C状态中解冻的精子活性呈急剧下降趋势，而这种趋势在–75°C时就开始出现。很快地，人们得出结论，如果需要长期冷冻包括精子细胞在内的所有人类细胞样本，则必须使样本在低于–100°C的状态下进行保存，因此，液氮就成为了普遍用于低温冻存的介质。以前，气相液氮低温冷冻方式未得到人们普遍关注，从理论上来说，长期保存样本需要在低于–130°C的状态下进行，因为–130°C是玻璃样本形成临界点，高于此温度将使细胞内形成冰晶，也不可能形成再结晶，这对细胞的损害是极大的。为了克服在液相中保存样本就必须使用Cryoflex外套或冻存管泄露的问题，法国液空（AirLiquide）发明了一种气相液氮冷冻系统，只需一个步骤就能使样本的平均存活率高于50%。这个系统操作简单，首先将精子-冻存液混合物等分量混合于冻存瓶中，再分装到盖有聚乙烯盖子的冻存管中，最后将冻存管放入液氮罐里的支架上，即可达到冷冻或保存作用。液氮罐里只含有15cm高的液相液氮，其余空间都被气相液氮填充。从室温降到–190°C（气相液氮，法国液空）的平均冷却速率因冻存管数量而异，约为每分钟10–20°C。我们观察到，每3个月测量12次窄口径液氮罐内的温度，都能稳定保持在–190°C左右，这表明，此种长期保存样本的方法是切实可行的。而在实验室使用宽口液氮罐过程中，铝制支架或导管能够减少温度梯度，所以即使在离瓶口较近的地方，也能达到–190°C。使用气相液氮保存样本时，必须每周测量几次液氮罐里的液氮量，或者配置可远程监控的液氮报警装置。应用气相液氮能达到稳定、低温的保存效果，与干冰保存法相比，这是具有明显优势的。我们应用气相液氮保存精子并用于精子细胞显微注射已经有两年半时间了，在此期间，我们贮存了70份精子样本，其中21份用于精子细胞显微注射（有9份来自于睾丸或附睾精子）。总体而言，受孕率达到56%，91%的受精卵出现卵裂现象。胚胎在第37个分裂周期时移植到母体中，一共检测到5例母体的HCG-ß表达水平有所提高，通过FH因子检测到4例妊娠者，成功妊娠率达到了20%。这些结果与精子细胞显微注射的结果是一样的。在下一个阶段，我们准备利用气相液氮法保存体外人工受精卵及捐赠者的样本。其他预防措施使用PVA粉进行封闭时，必须把样本等量分装到麦管中，保证一支麦管只能使用一次。但是，使用相同的PVA粉填充不同的样本时，就有可能出现交叉污染现象。解冻时，任何出现破裂或一端失去密封性的麦管都要丢弃，禁止使用。此外，麦管应该使用无菌剪刀或手术刀进行剪切，外部用次氯酸盐进行消毒后，才可用于辅助生育技术。样本在进行冻存或临床使用之前，应该有第二者在场，以确认所取样本是否是正确无误的。在同一时间同一地点，应该只有一份精子样本用于低温保存，以区别用于其他用途的样本（如分析用的精子样本，或用于做精子抗体测试的血样本）结论运用现有的储存方法进行精子样本的低温保存时，并用于辅助生育技术时，将面临着极大的交叉污染风险。我极力呼吁，精子银行应该严格监控所有的贮存程序，从开始就最大程度地降低交叉污染现象。就像骨髓细胞因为保存不当引起交叉污染而使患者染病一样，非要等到那些孕妇因为精子库的交叉污染而患上一系列疾病之后，才停止使用那些不合格的贮存方法吗？隔离罐虽有某些优点，但是它们不够完美，无法全部检测出所有病人所携带的某些病毒。Acknowledgments致谢TheauthorthanksJingHongAn,PeterElliottandHenryOhforperformingthecryopreservationprocedures,andAnneMcCartinfortyping