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高效液相色谱基础知识高效液相色谱基础知识高效液相色谱基础知识高效液相色谱基础知识天美科技液相培训教材（二）第五章第五章色谱柱的使用及保养色谱柱的使用及保养第五章第五章色谱柱的使用及保养色谱柱的使用及保养主要内容：主要内容：主要内容：主要内容：良好的色谱实验习惯色谱柱的使用及操作色谱柱的使用及操作色谱柱的保养z样品方面z流动相方面z在线的保护装置z保护柱z保护柱z色谱柱的清洗z色谱柱的存放z色谱柱的存放色谱柱常见毛病问题良好的色谱实验习惯良好的色谱实验习惯良好的色谱实验习惯良好的色谱实验习惯拿色谱柱柱•拿到一根新色谱柱时，先测柱效•保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件定期检测柱效•定期检测柱效•定期检测仪器的谱带展宽定期检测仪器的谱带展宽色谱柱的使用及操作色谱柱的使用及操作色谱柱的使用及操作色谱柱的使用及操作流动相的转换•流动相的转换–特别是GPC柱•流速(压力)的变化幅度•温度的变化幅度•温度的变化幅度•专用色谱柱∶样品及溶剂的要求记住∶拿到一根从未用过的色谱柱时记住拿到根从未用过的色谱柱时一定要先看其使用说明！色谱柱的保养色谱柱的保养色谱柱的保养（一）色谱柱的保养（一）样品方面•样品方面–除去微粒及杂质–了解样品在流动相中的溶解度如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出–了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用色谱柱的保养色谱柱的保养色谱柱的保养（二）色谱柱的保养（二）流动相方面•流动相方面–除去微粒纯度的要求–纯度的要求•超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低•缓冲液的pH值，在填料的允许范围内缓冲液的pH值，在填料的允许范围内•缓冲液（盐）的浓度•溶剂：色谱纯，并与填料相匹配•溶剂中的杂质含量–流动相对样品的溶解度有机溶剂或水的比例•有机溶剂或水的比例色谱柱的保养色谱柱的保养在线的保护装置在线的保护装置色谱柱的保养（三）色谱柱的保养（三）--在线的保护装置在线的保护装置给色谱柱提供物理的保护•给色谱柱提供物理的保护–除去样品及流动相中的颗粒给色谱柱提供化学的保护•给色谱柱提供化学的保护–防止分析柱被化学污染装•装置–在线过滤器–自装填料保护柱–预装保护柱色谱柱的保养四色谱柱的保养四保护柱保护柱色谱柱的保养（四）色谱柱的保养（四）--保护柱保护柱避免化学染多数保柱响个色谱柱的柱效•可避免化学污染。多数保护柱影响到整个色谱柱的柱效，特别是在用微柱时GdPk预装保护柱–Guard-Pak预装保护柱•有各种填料的预装柱供选择，使用方便。填料容积较小也引起柱效降低较小，也引起柱效降低色谱柱的保养五色谱柱的保养五色谱柱的清洗色谱柱的清洗色谱柱的保养（五）色谱柱的保养（五）--色谱柱的清洗色谱柱的清洗对所做的样品要有充分的了解•对所做的样品要有充分的了解用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗•硅胶柱的一般方法先用甲醇洗去极性杂质用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化•键合相柱(烷基)的一般方法20倍柱体积的：甲醇-二氯甲烷-甲醇-水依次冲洗记住∶每种色谱柱可能有特定的方法记住∶每种色谱柱可能有特定的方法一定要先看其使用说明！色谱柱的保养六色谱柱的保养六色谱柱的存放色谱柱的存放色谱柱的保养（六）色谱柱的保养（六）--色谱柱的存放色谱柱的存放•存放前的处理–除去杂质、盐除去杂质、盐•合适的存放溶剂•避免色谱柱床的干枯避免色谱柱床的干枯•避免机械震动•防止细菌生长防止细菌生长•注意存放的温度色谱柱常见毛病色谱柱常见毛病色谱柱常见毛病色谱柱常见毛病•柱压过高–多少才算高?9不同色谱柱有差异9不同系统有差异9不同溶剂有差异•柱效低效低•重复性差•不出峰，回收率低不出峰，回收率低色谱柱常见毛病色谱柱常见毛病柱压过高柱压过高色谱柱常见毛病色谱柱常见毛病--柱压过高柱压过高•为什么柱压会过高–微粒堵塞9样品9流动相9密封垫–柱床膨胀–不可逆吸附–细菌生长色谱柱常见毛病色谱柱常见毛病柱效低柱效低色谱柱常见毛病色谱柱常见毛病--柱效低柱效低为什么柱效低•为什么柱效低–色谱柱被污染–过滤片部分堵塞样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞–色谱柱内的死体积9流动相pH值及组成不合适造成固定相流失9流速急剧变化造成固定相物理损坏9机械震动造成固定相产生裂缝9柱床收缩或干枯色谱柱常见毛病色谱柱常见毛病重复性差回收率低重复性差回收率低色谱柱常见毛病色谱柱常见毛病--重复性差、回收率低重复性差、回收率低实验的重复性差•实验的重复性差–色谱柱被污染–流动相pH值及组成不合适造成键合相流失–样品溶剂不同或样品本身不稳定•回收率低，不出峰–“不可逆”吸附–固定相过强或流动相过弱–非特异性吸附色谱柱以外的因素色谱柱以外的因素色谱柱以外的因素（一）色谱柱以外的因素（一）柱效”问题不定是色谱柱问题•“柱效”问题，不一定是色谱柱问题！–仪器问题：连接不好造成死体积9进样器9检测器9管路，连接口9保护柱9在线过滤器堵塞–流动相问题：色谱柱未平衡好–进样量太大色谱柱以外的因素色谱柱以外的因素色谱柱以外的因素（二）色谱柱以外的因素（二）柱压过高问题不定是色谱柱问题•柱压过高问题，不一定是色谱柱问题！–系统反压问题9进样器堵塞9管路或连接口堵塞9在线过滤器不干净9保护柱–压力传感器不准确–流速是否错误?色谱柱以外的因素色谱柱以外的因素色谱柱以外的因素（三）色谱柱以外的因素（三）实验的重复性差•实验的重复性差–梯度实验时平衡时间不足–温度波动–流动相组成改变–样品溶剂不同–样品稳定性不好–方法的开发不好9缓冲液的pH值不合适9缓冲液的缓冲能力不足第六章第六章色谱仪的使用和维护色谱仪的使用和维护第六章第六章色谱仪的使用和维护色谱仪的使用和维护主要内容：主要内容：流动相流动相样品手动进样阀系统系统日常维护日常维护四元泵真空在线脱气机梯度单元流动相流动相流动相流动相要求要求色谱柱对流动相的要求要求要求色谱柱对流动相的要求与检测器匹配脱气脱气避免卤素离子（不锈钢系统）溶剂的黏度防止细菌的生长防止细菌的生长流动相流动相流动相流动相脱气目的¾色谱泵输液准确输液均匀准确脉减保峰性提高输液均匀准确，脉动减少，保留时间和峰面积重现性提高¾提高检测性能防治气泡引起尖蜂，基线稳定，信燥比增加，溶剂紫外本底降低¾保护色谱柱减少死体积，防止填料氧化方式方式¾加热：简单，效果好，但容易造成流动相组成变化¾抽真空：简单，效果较好。推荐设备：溶剂脱气机抽真空：简单，效果较好推荐设备：溶剂脱气机¾超声波：简单，但效果不理想。推荐设备：超声波清洗仪¾通惰性气（氦气）：可保持连续脱气，多用于低压梯度，费用较高¾在线脱气机：可保持连续脱气，多用于低压梯度，只需一次性投资¾在线脱气机：可保持连续脱气，多用于低压梯度，只需次性投资流动相流动相流动相流动相更换更换更换更换第一次启动泵用甲醇冲洗系统，停用，甲醇充满，以防长菌更换新的流动相，用与两种流动相都互溶的溶剂做过渡，同时注意流动相别毁坏色谱柱使用过滤的、脱气的流动相，不使用放置过久的蒸馏水，可加入10-4-10-3M的叠氮化纳梯度洗脱时，最好使用粘度相同或相近的溶剂组成流动相储液瓶中流动相的液位至少要高出流动相入口处10cm，防止气泡进入溶剂中流动相流动相流动相流动相污染的溶剂或溶剂瓶里的藻类生长将会缩短溶剂过滤器的使用寿污染的溶剂或溶剂瓶里的藻类生长将会缩短溶剂过滤器的使用寿命，并且影响泵的运行。这在水溶剂或磷酸盐缓冲液(pH4至7)中尤其如此。下列建议将会延长溶剂过滤器的使用寿命并维持泵的运行的运行。z使用灭过菌的溶剂瓶来减缓藻类生长。使用新鲜配制的流动相特别是水溶剂或盐缓冲液建议不超过z使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或盐缓冲液建议不超过两天。z如果应用许可在溶剂中加人00001－0001M的叠氮化钠z如果应用许可，在溶剂中加人0.00010.001M的叠氮化钠。z避免溶剂瓶暴露在直射阳光下。z用氩气置换流动相上层的空气。z定期清洗溶剂过滤器及溶剂瓶，每三个月至少清洗一次。z注意：不要使用没有安装溶剂过滤器的系统．可能会严重堵塞系统系统在线脱气机在线脱气机在线脱气机在线脱气机在线脱气机在线脱气机在线脱气机在线脱气机z简单判断脱气机脱气是否正常打开Purge阀设定泵的流速2ml/min提起当前所使用打开Purge阀，设定泵的流速2ml/min，提起当前所使用溶剂瓶内的溶剂过滤头，使之脱离液面一小段时间，此时溶剂传送管内会产生一小段气泡，放下过滤头，让此段气泡通过脱气机如果脱气机正常气泡应消失或缩小过脱气机，如果脱气机正常，气泡应消失或缩小。z简单判断脱气机腔体或溶剂过滤头是否堵塞、关闭泵，拧开脱气机出口或比例阀入口管线，此时溶剂会因为重力流出，脱气机或溶剂过滤头堵塞时，溶剂会流出不畅或不流出不畅或不流出。比例阀比例阀z判断比例阀是否内漏设定泵使用一个单独通路(A)，打开Purge阀，流速设定泵使用个单独通路()，打开g阀，流速5ml/min，提起其他溶剂瓶内的溶剂过滤头直至离开液面，观察这些通路(B、C、D)内的溶剂是否随着流动，正常时均不应流动。时均不应流动。z判断何时应该更换Purge阀内的过滤白头z判断何时应该更换Purge阀内的过滤白头使用纯水作流动相，打开Purge阀，流速5ml/min，观察系统压力，如果超过10bar，应该更换。单向阀单向阀功能检查方法在在线过滤器中人为地引入气泡，将流量设定为1.0ml/min，然后观察气泡在聚四氟乙烯管中的运动状态：如果气泡是平稳的上升，说明两个单相阀的功能都是正常的，如果气泡是上去了而后又下来了，说明吸入阀出现了故障如果气泡静止不动或缓慢上升明吸入阀出现了故障，如果气泡静止不动或缓慢上升，说明排出阀出现了故障。样品样品样品样品要求要求除去微粒和杂质要求要求除去微粒和杂质了解样品在流动相中的溶解度。如果样品的溶剂不是流动相一定要用流动相试溶解度防止其在流动相中析出相，定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出了解样品与色谱柱的基质、填料是否相互作用避免超负荷进样对250×46mm的柱子绝对进样量应不避免超负荷进样,对250×4.6mm的柱子,绝对进样量应不超过100μg。在灵敏度允许的前提下,应尽量将试样浓度降低,减少绝对进样量(进样体积可保持不变),这是保持HPLC柱性减少绝对进样量(进样体积可保持不变),这是保持柱性能持久良好的重要举措之一。动进样动进样手动进样器手动进样器手动进样器手动进样器手动进样器手动进样器如何判断手动进样器的密封圈漏夜通常结合两个方面：通常结合两个方面：1、从进样器观察，进样后将针拔出，若从进样口或排空管有液体冒出，显示密封圈磨损。2从结果看：通常有压力不稳定峰面积或保留时间不稳2、从结果看：通常有压力不稳定，峰面积或保留时间不稳定和残留严重。手动进样器手动进样器手动进样器手动进样器为了防止虹吸应注意使放空管的出口与进样口保持在同为了防止虹吸应注意使放空管的出口与进样口保持在同一平面为了更好的重现性，进样体积最好是样品环的5-6倍。手动进样阀手动进样阀手动进样阀手动进样阀测试完后，使用阀附带的冲洗附件对进样阀入口进行冲洗，测试完后，使用阀附带的冲洗附件对进样阀入口进行冲洗，切换Load和Inject档位反复冲洗如果是梯度洗脱方式，让进样阀保持在Inject位置，到下次如果是梯度洗脱方式，让进样阀保持在Inject位置，到下次进样前1~2分钟切换回Load位置，将进样器从进样阀中拔出进样时确保进样针中无气泡，进样时样品的浓度应从低到进样时确保进样针中无气泡，进样时样品的浓度应从低到高，如果进样顺序是样品的浓度从高到低，在下次进样前应用流动相彻底清洗进样阀和进样器要使用专用的液相平头注射器进样；绝对不可以用气相的注射器，会严重刮坏转子垫圈扳动手动进样阀时速度要快，否则容易引起局部压力过高，损坏阀系统系统如果流动相的水相中含有无机盐时，建议使用“柱塞杆的在线清洗装置”。在关闭系统之前应用CH3OH—H2O(20:80)继续冲