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书书书酸性环境中亚铁离子对紫花苜蓿犠犔５２５早期生长和生理的影响李剑峰１，２，师尚礼１，２，张淑卿１，２（１．甘肃农业大学草业学院，甘肃兰州７３００７０；２．草业生态系统教育部重点实验室中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃兰州７３００７０）摘要：采用砂培的方法研究酸性（ｐＨ值４．５）土壤下Ｆｅ２＋对苜蓿生长和生理的影响。结果表明，土壤Ｆｅ２＋含量在１０～１００ｍｇ／ｋｇ时苜蓿生长正常，出苗率、株高、单叶面积、单株叶片数、地上及地下生物量不低于对照组（ｐＨ值６，Ｆｅ２＋１０ｍｇ／ｋｇ）；在５０ｍｇ／ｋｇＦｅ２＋含量下，苜蓿生长受到促进，各指标均高于或显著（犘＜０．０５）高于其他处理；而Ｆｅ２＋含量在１００～２００ｍｇ／ｋｇ时，幼苗的生长受到严重抑制，出苗率、株高、叶片长度、单株叶片数、根长和地上及地下生物量均显著低于（犘＜０．０５）其他处理；不同Ｆｅ２＋含量下，苜蓿的叶片电导率、ＭＤＡ含量、根系活力、可溶性糖含量，光化学效率（Ｆｖ／Ｆｍ）和光系统Ⅱ潜在活性（Ｆｖ／Ｆｏ）均存在显著差异，＜１００ｍｇ／ｋｇＦｅ２＋含量处理下的根系活力、光化学效率（Ｆｖ／Ｆｍ）和光系统Ⅱ潜在活性（Ｆｖ／Ｆｏ）显著高于１００～２００ｍｇ／ｋｇＦｅ２＋处理，但叶绿素含量与铁离子浓度间并不存在显著的相关性。关键词：亚铁离子；紫花苜蓿；酸性土壤；生长中图分类号：Ｓ５５１＋．７０１；Ｑ９４５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２００９）０５００１００８ ２０世纪９０年代中期以来，应农业结构调整、畜牧业发展的需要及国家退耕还草政策的要求，苜蓿产业逐步发展成为我国农业领域新兴产业。紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）是一种优良的豆科牧草，营养价值居牧草之首，适宜生长在ｐＨ值６．５～７．５的微酸至微碱性土壤中，一般认为紫花苜蓿不适宜在酸性土壤种植。我国广阔的红壤土区域普遍偏酸性（ｐＨ值＜５．０），甚至呈现强酸性（ｐＨ值＜４．５），限制了紫花苜蓿在这些地区（如我国广东、广西和海南等省份）的种植［１］。２０世纪９０年代之前，人们曾在该类地区进行过紫花苜蓿的引种，但最后大多失败［２］。近年的研究表明，部分半秋眠和非秋眠紫花苜蓿品种在强酸性土壤中亦可正常生长［３］。李剑峰［４］用砂培方法研究了紫花苜蓿生长与土壤酸度的关系，发现在ｐＨ值低于７的环境下，仅就单一的酸度因素而言，ｐＨ＝５的酸性环境最适于苜蓿的生长发育，说明南方地区普遍存在的酸性土壤对紫花苜蓿生长的抑制作用除酸性本身外，还有其他更主要的因素。土壤中的铁元素含量丰富，在土壤溶液中多以Ｆｅ２＋的形式存在［５，６］，是土壤中可溶性铁的主要形态，也是能被植物所吸收的形态，土壤环境ｐＨ值的降低可以促进铁素形态的溶解平衡向液相中Ｆｅ２＋浓度增加的方向移动，环境ｐＨ值高于４时，ｐＨ值每增减１个单位，Ｆｅ２＋活度就会增减１０００倍。因此酸性土壤中的可溶性铁的含量比中性或碱性土壤高；作为植物生长发育所必需的矿质营养元素之一，铁元素在植物生理代谢过程中发挥着极为重要的作用［７］。而过多的亚铁离子对植物的生长是有害的，大量的Ｆｅ２＋可通过干扰Ｐ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ等矿质元素的吸收造成元素营养障碍［８，９］，同时诱发产生多种攻击膜脂的活性自由基的链式反应，导致脂质的过氧化和膜的损伤［１０］，破坏植物组织的结构，降低根系吸收水分和营养物质的能力，降低植物产量。在酸性土壤中，不同含量的亚铁离子对紫花苜蓿生长的影响存在较大差异。本研究旨在研究酸性土壤中不同含量亚铁离子对紫花苜蓿生长和生理的影响，为紫花苜蓿在酸性土壤中的推广种植和紫花苜蓿耐酸、铁胁迫的进一步研究提供依据。１０－１７２００９年１０月 草 业 学 报 ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 第１８卷 第５期Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．５收稿日期：２００８１２０５；改回日期：２００９０２１９基金项目：国家科技部“西北优势和特色牧草生产加工关键技术研究与示范”（２００７ＢＡＤ５２Ｂ０６），“奶牛优质饲草生产技术研究及开发”（２００６ＢＡＤ０４Ａ０４），“优质抗逆专用草新品种选育”（２００６ＢＡＤ０１Ａ１９）、农业部行业专项“人工草地优质牧草生产技术研究与示范”（ｎｙｈｙｚｘ０７０２２）和现代农业产业技术体系建设专项奖金资助。作者简介：李剑峰（１９７９），男，甘肃天水人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｌｊｆｓｍａｒｔ＠ｑｑ．ｃｏｍ通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｓｈｉｓｈｌ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ１ 材料与方法１．１ 试验材料及设计１．１．１ 供试材料 供试苜蓿品种为中种草业公司提供的ＷＬ５２５，种子用０．１％ＨｇＣｌ消毒１０ｍｉｎ，去离子水冲洗干净后播种。１．１．２ 无铁Ｈｏｇｌａｎｄ营养液的制备 大量元素：Ｃａ（ＮＯ３）２·４Ｈ２Ｏ１４１７ｍｇ／Ｌ；ＫＮＯ３６０７ｍｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ４４９３ｍｇ／Ｌ；（ＮＨ４）３ＰＯ４１１５ｍｇ／Ｌ；微量元素：Ｈ３ＢＯ３２．８６ｍｇ／Ｌ；ＭｎＣｌ２·４Ｈ２Ｏ１．８１ｍｇ／Ｌ；ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．２２ｍｇ／Ｌ；ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ０．０８ｍｇ／Ｌ；Ｈ２ＭｏＯ４·Ｈ２Ｏ０．０２ｍｇ／Ｌ。营养液以去离子水稀释至１／４浓度后用ＮａＯＨ（１ｍｏｌ／Ｌ）或ＨＣｌ（１ｍｏｌ／Ｌ）调节ｐＨ值至所需酸度。１．１．３ 试验设计 试验于２００７年进行，采用细沙作为栽培基质，经ＨＣｌ浸泡后用去离子水清洗烘干备用。在直径９ｃｍ，深７ｃｍ，容积为６００ｍＬ的塑料花盆内铺设与底面形状一致的无纺布，盆内装入３００ｇ干燥细沙并将沙面平整，用镊子挑选２０粒大小一致的饱满种子均匀摆放细沙表面，覆盖干沙５０ｇ。Ｆｅ２＋（硫酸亚铁）用量为每ｋｇ栽培基质１０，５０，１００，１５０和２００ｍｇＦｅ２＋共５个浓度处理，设弱酸环境（ｐＨ＝６），Ｆｅ２＋＝１０ｍｇ／ｋｇ为对照，每个亚铁离子处理重复６盆。将各处理塑料盆称重后分别置入盛有ｐＨ＝４．５的无铁１／４Ｈｏｇｌａｎｄ营养液的水槽中，使营养液能缓慢由底部渗入，并在盆内形成高于沙表面３～５ｍｍ的液面，然后用便携式ｐＨ计测定其ｐＨ值，直至液面ｐＨ值为４．５时将盆取出，再次称重。每１２ｈ称量盆栽重量，以相应酸度和浓度的ＦｅＳＯ４溶液，用刻度喷雾瓶将Ｆｅ２＋施入塑料盆补充重量至最大持水，直至铁离子施入完全。处理后每３ｄ称量各盆栽重量，并用ｐＨ＝４．５的无铁１／４Ｈｏｇｌａｎｄ营养液补充蒸散掉的水分。对照采用ｐＨ＝６的相同溶液处理。１．２ 测定指标和方法１．２．１ 出苗率、生物量、根瘤数的比较 播种后每天记录各处理的出苗数，计算出苗率；每处理盆栽随机标记３株幼苗用于测量株高、叶片数、以描形称重法于出苗４６ｄ时测定每标记株自株顶向下第６叶的单叶叶面积［１１］；出苗４６ｄ时，将栽培基质和苜蓿苗从盆中整体取出用水冲洗，直至全株完全冲洗干净，然后取出标记植株，测定其根系长度、根瘤数目、根瘤等级、单株地上生物量和地下生物量。１．２．２ 细胞膜透性的测定 称取苜蓿叶片０．２ｇ，置入盛有去离子水的试管中，真空泵中抽气３０ｍｉｎ使叶片浸没于水。静置２０ｍｉｎ后，用ＤＤＳ３２０型电导仪测定溶液电导率。再放入沸水浴中加热３０ｍｉｎ，冷却至室温后测定其煮沸电导率。重复３次取其平均值。用公式计算其相对电导率：相对电导率（％）＝处理后叶片电导率×１００／煮沸电导率。１．２．３ 植株根系活力的测定 称取植物新鲜根系０．１５ｇ，将根浸没于含０．２％ＴＴＣ（氯化三苯基四氮唑）的６６．７ｍｍｏｌ／Ｌ的磷酸缓冲液，避光３７℃保温１ｈ后加入１ｍｏｌ／Ｌ的硫酸终止反应。取出根研磨后用乙酸乙酯反复提取红色的ＴＴＣ还原产物三苯甲僭（ＴＴＦ），４８５ｎｍ波长下测定提取液的ＯＤ值。根据标准曲线计算ＴＴＣ还原量。以单位时间内单位鲜根还原ＴＴＣ的量（ｍｇ／ｇＦＷ·ｈ）表示根系还原力，以此反映植株的根系活力。１．２．４ 叶片色素含量的测定 采用吸光度法，称取０．５ｇ新鲜叶片，加８０％的丙酮研磨提取后在波长６６３，６４６，４７０ｎｍ处读取吸光度。根据修正的Ａｒｎｏｎ公式计算浓度，修正的Ａｒｎｏｎ公式为：Ｃａ＝１２．２１×Ａ６６３－２．８１×Ａ６４６Ｃｂ＝２０．１３×Ａ６４６－５．０３×Ａ４７０式中，Ｃａ、Ｃｂ分别为叶绿素ａ、叶绿素ｂ的浓度；Ａ６６３、Ａ６４６、Ａ４７０分别为色素提取液在波长６６３，６４６，４７０ｎｍ处的吸光度。色素含量（ｍｇ／ｇ）＝色素浓度×提取液体积×稀释倍数／样品鲜重１．２．５ 丙二醛ＭＤＡ含量的测定 采用硫代巴比妥酸法［１２］。１．２．６ 叶片可溶性糖含量的测定 采用蒽酮比色法［１３］。１．２．７ 叶绿素荧光特性的测定 用ＦＭＳ２型便携式调制荧光分析仪（Ｈａｎｓａｔｅｃｈ公司）进行叶绿素荧光动力学１１第１８卷第５期草业学报２００９年参数测定。测定前将叶片暗适应３０ｍｉｎ后测定Ｆｏ（初始荧光）、Ｆｍ（最大荧光）、Ｆｖ（可变荧光），计算Ｆｖ／Ｆｍ（叶片ＰＳⅡ原初光能转化效率）和Ｆｖ／Ｆｏ（ＰＳⅡ潜在活性）。１．３ 数据分析采用ＤＰＳ３．０专业统计分析软件进行数据分析和差异显著性检验。２ 结果与分析２．１ Ｆｅ２＋处理对苜蓿出苗率和存活率的影响Ｆｅ２＋对苜蓿种子出苗率的影响与砂培基质中Ｆｅ２＋的含量有关，处理１４ｄ后观测出含量组（≤５０ｍｇ／ｋｇ）的发芽率高于对照组（ｐＨ＝６，１０ｍｇ／ｋｇ），而高含量组（≥１００ｍｇ／ｋｇ）发芽率显著低于对照组（犘＜０．０５）；出苗４０ｄ后，≤１００ｍｇ／ｋｇＦｅ２＋处理的植株成活率与对照差异不大，≥１５０ｍｇ／ｋｇＦｅ２＋处理的成活率均显著低于对照；种子发芽率和幼苗成活率与Ｆｅ２＋含量呈显著的负相关，随Ｆｅ２＋浓度的增大表现出下降的趋势（表１），相关系数狉分别为－０．９３４，－０．８３３（显著相关，极显著相关），其中Ｆｅ２＋浓度对出苗率的影响显著大于植株的存活率，说明植株在出苗后，对于高含量的Ｆｅ２＋具备一定的耐受能力。１０ｍｇ／ｋｇＦｅ２＋处理的出苗率和存活率均略高于对照，这是由于低浓度的Ｆｅ２＋在酸性条件下对植株的有效性高于弱酸性环境所致。表１ 犉犲２＋处理对紫花苜蓿出苗率和存活率的影响犜犪犫犾犲１ 犈犳犳犲犮狋狅犳犉犲２＋犮狅狀狋犲狀狋狅狀狋犺犲犵犲狉犿犻狀犪狋犲犱狉犪狋犲犪狀犱狊狌狉狏犻狏犲狉犪狋犲狅犳犕．狊犪狋犻狏犪Ｆｅ２＋浓度Ｃｏｎｔｅｎｔ（ｍｇ／ｋｇ）处理第１４天的出苗率Ｇｅｒｍｉｎａｔｅｄｒａｔｅｉｎ１４ｄ（％）处理４０ｄ后的植株存活率Ｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅａｆｔｅｒ４０ｄ（％）１０８０．００±５．４３ａ８９．５１±２．７６ａ５０７１．６７±７．６４ａｂ８８．８０±６．５４ａ１００５３．３３±５．７７ｃｄ８３．４４±５．０９ａｂ１５０４５．００±０．５５ｄ７７．１３±３．４２ｂ２００４７．６３±２．６４ｄ４９．５４±５．２３ｃＣＫ７０．００±３．４３ａｂ８８．１０±３．１２ａ ＣＫ：对照。Ｃｏｎｔｒｏｌ．不同小写字母表示差异显著（犘＜０．０５）。下同。Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ犘＜０．０５ｌｅｖｅｌ．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．２．２ Ｆｅ２＋处理对苜蓿株高，叶片数和叶面积的影响环境中的亚铁离子含量对于苜蓿幼苗的生长速率有很大的影响（图１），在试验期间，１０和５０ｍｇ／ｋｇ处理的植株高度最高，在２７ｄ后显著高于１００，１５０和２００ｍｇ／ｋｇ的处理（犘＜０．０５）。１００～２００ｍｇ／ｋｇ各处理间的植株高度差异始终不明显，但都显著低于对照。Ｆｅ２＋在２７～４０ｄ期间对植株高度的影响明显强于在０～１５ｄ期间的影响。试验期间，１００ｍｇ／ｋｇＦｅ２＋处理的单株叶片数最多，并在出苗１０ｄ时明显高于其他处理（图２）；但在出苗１６ｄ时，所有处理间叶片数目差异不大；出苗４０ｄ时，１００～２００ｍｇ／ｋｇ各处理叶片数随Ｆｅ２＋含量的增大而依次显图１ 犉犲２＋处理浓度对紫花苜蓿生长高度的影响犉犻犵．１ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犉犲２＋犮狅狀狋犲狀狋狅狀狊犺狅狅狋犺犲犻犵犺狋狅犳犕．狊犪狋犻狏犪图２ 犉犲２＋处理对