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中华人民共和国国家标准蜂蜜中四环素族抗生素残留量的测定方法GB/T13110-91Methodfordeterminationoftetracyclinesresidueinhoney━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━1主题内容与适用范围本标准规定了用微生物管碟法测定蜂蜜中四环素族抗生素残留量的方法。本标准适用于天然或加工蜂蜜中四环素族抗生素残留量的测定。2原理样品中四环素族抗生素经Mcllvaine缓冲液提取后,用SEP-PAKC18柱纯化。四环素族三种抗生素四环素、土霉素及金霉素利用薄层层析生物检测法进行分离和定性；以蜡样芽胞杆菌为试验菌株,用微生物管碟法进行定量检测。3试剂所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。3.1Mcllvaine缓冲液(pH4)：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)27.6g、柠檬酸(C6H8O7·H2O)12.9g、乙二胺四乙酸二钠盐37.2g，用水溶解后稀释并定容至1000mL。3.20.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH4.5)：称取磷酸氢二钾13.6g,用水溶解后稀释并定容至1000mL,115℃灭菌30min，置4℃冰箱中保存。3.35%乙二胺四乙酸二钠盐水溶液。3.4WatersSEP-PAKC18柱(或国产PT-C18柱)：用时先经10mL甲醇滤过活化,再用10mL蒸馏水置换，然后用10mL5%乙二胺四乙酸二钠盐流过。3.5标准抗生素：四环素、土霉素，金霉素标准品由卫生部药品生物制品检定所提供。3.6抗生素标准原液和稀释液3.6.1抗生素标准原液配制：精确称取四环素，土霉素、金霉素标准品适量(按效价进行换算)，用0.01mol/L盐酸溶解并定容至1000μg/mL，置4℃冰箱中(可使用7天)。3.6.2抗生素标准稀释液配制：临用前取上述原液按1:0.8剂距用0.1mol/L磷酸盐缓冲液逐步稀释配制成标准稀释液。制备四环素、土霉素标准曲线的标准浓度为0.16,0.21,0.260.32,0.40,0.50μg/mL,参考浓度为0.25μg/mL；制备金霉素标准曲线的标准浓度为0.0330.041,0.051,0.064,0.08,0.10μg/mL,参考浓度为0.05μg/mL。定性试验用标准液浓度四环素，土霉素为2μg/mL，金霉素为1μg/mL。3.7展开剂：正丁醇-醋酸-水(4：1：5)。4仪器4.1隔水式恒温箱。4.2冰箱:0～4℃。4.3恒温水浴。4.4高压灭菌器。4.5旋转式减压蒸馏器。4.6离心机：2000r/min。4.7天平：感量0.1mg。4.8层析缸：内长20cm、宽15cm、高30cm。4.9长方形培养皿：1.5cm×8cm×23cm。4.10层析纸：7cm×22cm，中速滤纸。4.11微量注射器：10μL、50μL。4.12电吹风机。4.13游标卡尺。4.14吸管：容量为1mL和10mL，标有0.1mL单位刻度。4.15注射器：容量为20mL。4.16平皿：内径为90mm，高16～17mm，底部平整光滑，具陶瓷盖。4.17不锈钢小管(简称小管)：内径6.0±0.1mm，外径7.8±0.1mm，高度10±0.1mm。5培养基5.1菌种培养基：胰蛋白胨10.0g；牛肉浸膏5.0g;氯化钠2.5g;琼脂14～16g;蒸馏水1000mL。将上述各成分混合于蒸馏水中，搅拌加热至溶解，110℃灭菌30min，最终pH值为7.2～7.4。5.2检定用培养基：胰蛋白胨5.0g；牛肉浸膏3.0g；磷酸氢二钾3.0g；琼脂14～16g；蒸馏水1000mL。将上述各成分混合于蒸馏水中，搅拌加热至溶解，110℃灭菌30min，最终pH值为6.5±0.1。6试样处理6.1定量试验用样液制备：称取混匀的蜂蜜样品10.0g，加入30mLpH4.0的Mcllvaine缓冲液，搅拌均匀，待溶解后进行过滤，滤液分数次置于注射器中，用经预处理的SEP-PAKC18柱滤过，用50mL水洗柱，再用10mL甲醇洗脱，洗脱液经40℃减压浓缩蒸干后，准确加入PH4.5磷酸盐缓冲液3～4mL溶解，备定量检测用。6.2定性试验用样液制备：称取蜂蜜样品5g,按6.1步骤处理，甲醇洗脱液经40℃减压浓缩蒸干后，用0.1mL甲醇溶解，备定性试验用。7菌液和检定用平板的制备7.1试验菌种：蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereusvar.mycoides)，菌号63301，由卫生部药品生物制品检定所提供。7.2菌液的制备：将菌种移种于盛有菌种用培养基的克氏瓶内，于37℃培养7天，使镜检芽胞数达85%，先用10mL灭菌水洗下菌苔，离心20min，弃去上清液，重复操作一次，再加10mL灭菌水于沉淀物中，混匀。然后，将此芽胞悬浮液置65℃恒温水浴中加热30min，从水浴中取出,于室温下放置24h，再于65℃恒温水浴中加热30min，待冷后置4℃冰箱保存。用时可取此芽胞悬液以灭菌水稀释10倍成稀菌液。7.3芽胞悬液用量的测定：把不同量的稀菌液加入检定用培养基中,按本法进行操作，0.25μg/mL的四环素参考浓度可产生15mm以上的清晰、完整的抑菌圈，选择出最适宜的芽胞悬液用量。一般为每100mL检定用培养基加入0.2～0.5mL稀菌液。7.4检定用平板的制备：试验用平皿内预先铺有20mL检定培养基作为底层，将适量稀菌液(已于7.3中确定)加到溶化后冷却至55～60℃的检定用培养基中，混匀后往上述平皿内加入5mL作为菌层。前后摇动平皿，使菌层均匀覆盖于底层表面，置水平位置上，盖上陶瓷盖，待凝固后，每个平板的培养基表面放置6个小管，使小管在半径2.3cm的圆面上成60°角的间距。所用平板须当天准备。8定量试验8.1标准曲线的制备：取3个检定用平板为一组，6个标准浓度需要六组，在该组每个检定用平板的3个间隔小管内注满一参考浓度液，在另3个小管内注满一标准浓度液，于37±1℃培养16h，然后测量参考浓度和标准浓度的抑菌圈直径，求得各自9个数值的平均值,并计算出各组内标准浓度与参考浓度抑菌圈直径平均值的差值F，以标准浓度C为纵坐标，以相应的F值为横坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线。8.2样品测定：每份样品取3个检定用平板,在每个平板上3个间隔的小管内注满0.25μg/mL四环素参考浓度(或0.25μg/mL土霉素或0.05μg/mL金霉素，视所含抗生素种类而定),另3个小管内注满被检样液，于37±1℃培养16h，测量参考浓度和被检样液的抑菌圈直径，求得各自9个数值的平均值，并计算出被检样液与参考浓度抑菌圈直径平均值的差值Ft。9定性试验取层析用滤纸(7cm×22cm)均匀喷上0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH4.5)，于空气中晾干、备用。在距滤纸底边2.5cm起始线上,分别滴加10μL2μg/mL四环素、土霉素及1μg/mL金霉素标准稀释液与定性试验样液，将滤纸挂于盛有展开剂(3.7)的层析缸中，以上行法展开，待溶剂前沿展至15cm处将滤纸取出，于空气中晾干，贴在事先加有60mL含有试验用菌菌层的长方形培养皿上,30min后移去滤纸，在37±1℃培养16h，由抑菌圈测得比移值，以确定被检样品中所含四环素族抗生素的种类。10样品中四环素族抗生素残留量计算根据被检样液与参考浓度抑菌圈直径平均值的差值Ft，从该种抗生素标准曲线上查出抗生素的浓度ct(μg/mL)，样品中若同时存在二种以上四环素族抗生素时，除了四环素、金霉素共存以金霉素表示结果外，其余情况均以土霉素表示结果。样品中四环素族抗生素残留量按下式进行计算：ct×V×1000X=━━━━━━━━━━━m×1000式中:X──样品中四环素族抗生素残留量,mg/kg;ct──检定用样液中四环素族抗生素的浓度，μg/mL;V──待检定样液的体积，mL;m─—样品质量，g。━━━━━━━━━━━附加说明：本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准由福建省食品卫生监督检验所，福建省药品检验所负责起草。本标准主要起草人林升清、马赛骏、黄宏南、耿莹莹、林桂生。本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━中华人民共和国卫生部1991-06-07批准1992-03-01实施