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书书书犐犆犛０７．０８０犃４０!#$%&’’()*犌犅／犜３８０８６—２０１９!#$%&’()*+,-./犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犿犲狋犪犾犾狅狋犺犻狅狀犲犻狀（犕犜）犻狀犫犻狅犾狅犵犻犮犪犾狊犪犿狆犾犲狊２０１９１０１８01２０１９１０１８23’(+,-./012!’’()*3/045601书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由全国生化检测标准化技术委员会（ＳＡＣ／ＴＣ３８７）提出并归口。本标准起草单位：国家农业标准化监测与研究中心（黑龙江）、深圳市计量质量检测研究院、上海市计量测试技术研究院、成都大学四川抗菌素工业研究所、吉林省检验检疫局技术中心、哈尔滨商业大学食品学院、哈尔滨春源生物科技开发有限公司。本标准主要起草人：王志强、王韦达、董珊、周婕、杜业刚、李兰英、杨晨、容会、张根生、张福源、吴楠、彭丽萍、王世琨、姜雯、刘文超、孔鲁裔、牟钰、徐凤霞、王海宽、李碧芳、杨俊、李意、刘奕雄、杨国武。Ⅰ犌犅／犜３８０８６—２０１９生物样品中金属硫蛋白含量的测定１ 范围本标准规定了生物样品中兔源金属硫蛋白Ⅰ型和Ⅱ型（ＭＴⅠ和ＭＴⅡ）测定的液相色谱串联质谱法。本标准适用于生物制剂或生物提取物等生物样品中兔源金属硫蛋白Ⅰ型和Ⅱ型总含量的测定。本方法的检出限为６．２ｍｇ／ｋｇ。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法３ 术语和定义、缩略语３．１ 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１．１ 特征肽段 狊狆犲犮犻犳犻犮狆狅犾狔狆犲狆狋犻犱犲唯一在靶蛋白的胰蛋白酶水解产物中发现、其氨基酸序列具有专属性的多肽。３．１．２ 金属硫蛋白 犿犲狋犪犾犾狅狋犺犻狅狀犲犻狀一类富含半胱氨酸且具有高度结合金属能力的低相对分子质量蛋白质。３．１．３ 金属硫蛋白Ⅰ型和Ⅱ型 犿犲狋犪犾犾狅狋犺犻狅狀犲犻狀Ⅰ犪狀犱Ⅱ在大多数哺乳动物的内脏器官中广泛存在，尤以肝、肾细胞为主，而且参加其功能调节的一类蛋白质。３．２ 缩略语下列缩略语适用于本文件。ＤＴＴ：二硫苏糖醇（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）ＩＡＡ：碘代乙酰胺（２Ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）ＭＴ：金属硫蛋白（Ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）４ 原理试样经胰蛋白酶酶切后产生特征肽段，用液相色谱串联质谱法测定试样中特征肽段的含量，按照兔源ＭＴⅠ和ＭＴⅡ平均相对分子质量与特征肽段的相对分子质量比值为６．１６，计算出试样中ＭＴⅠ１犌犅／犜３８０８６—２０１９和ＭＴⅡ的总含量。５ 试剂试验用水为ＧＢ／Ｔ６６８２中规定的一级水。５．１ 碳酸氢铵（ＮＨ４ＨＣＯ３）：分析纯。５．２ 二硫苏糖醇（Ｃ４Ｈ１０Ｏ２Ｓ２）：生化级。５．３ 碘代乙酰胺（ＩＣＨ２ＣＯＮＨ２）：生化级。５．４ 胰蛋白酶：测序级，活力大于１００００ＢＡＥＥＵｎｉｔ／ｍｇ（ＢＡＥＥ是测定胰蛋白酶活性的底物），－１８℃冷冻保存。５．５ 甲酸（ＨＣＯＯＨ）：色谱纯。５．６ 乙腈（ＣＨ３ＣＮ）：色谱纯。５．７ 碳酸氢铵溶液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）：称取０．３９５ｇ碳酸氢铵，用水溶解后定容至５０ｍＬ。５．８ 二硫苏糖醇溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）：称取１．５４２ｇ二硫苏糖醇，用碳酸氢铵溶液溶解后定容至１０ｍＬ。５．９ 碘代乙酰胺溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）：称取１．８５０ｇ碘代乙酰胺，用碳酸氢铵溶液溶解后定容至１０ｍＬ。５．１０ 胰蛋白酶溶液（２００μｇ／ｍＬ）：移取２０μｇ胰蛋白酶用１００μＬ碳酸氢铵溶液溶解。５．１１ 甲酸溶液（０．１％，体积分数）：移取１．０ｍＬ甲酸，用水定容至１０００ｍＬ。６ 仪器设备及器具６．１ 液相色谱串联质谱仪：配电喷雾离子源。６．２ 蛋白超滤管：５０００Ｄａ～１００００Ｄａ（１Ｄａ≈１．６６×１０－２７ｋｇ）。６．３ 蛋白低吸附离心管：１．５ｍＬ。６．４ 天平：感量０．０１ｇ、０．００００１ｇ。６．５ 涡旋混合器。６．６ 微量移液器：１μＬ～１０μＬ、２０μＬ～２００μＬ、１００μＬ～１０００μＬ。６．７ 高速冷冻离心机：最高转速不低于１４０００ｒ／ｍｉｎ。６．８ 恒温水浴锅：３７℃。７ 分析步骤７．１ 特征肽段合成序列ＣＡＱＧＣＩＣＫ为合成肽段，经脱盐纯化工艺，其中的半胱氨酸是由碘代乙酰胺试剂进行了烷基化修饰，标记为［ＣＡＭ］。合成的特征肽段物质信息见附录Ａ。特征肽段－１８℃冷冻保存。７．２ 特征肽段溶液配制特征肽段储备溶液：准确称取肽段０．００２０ｇ溶于１．０ｍＬ碳酸氢铵溶液中，制备成２．０μｇ／μＬ储备液，－１８℃冷冻保存，有效期１个月。标准工作溶液：用碳酸氢铵溶液稀释上述特征肽段储备溶液，配制成１６０μＬ中含特征肽段质量为０．４μｇ、０．６μｇ、０．８μｇ、１．０μｇ、１．２μｇ、１．４μｇ、１．６μｇ、１．８μｇ和２．０μｇ的工作溶液，现用现配。２犌犅／犜３８０８６—２０１９７．３ 测定７．３．１ 试样制备称取０．００２ｇ（精确至０．０００１ｇ）试样，置于１．５ｍＬ低吸附离心管中，用１ｍＬ碳酸氢铵溶液溶解，混匀。移取１２５μＬ溶液转移至另一低吸附离心管中，加入８７５μＬ碳酸氢铵溶液，涡旋混匀，待酶解。７．３．２ 试样酶解取上述试样４０μＬ置于１．５ｍＬ低吸附离心管中，依次加６０μＬ碳酸氢铵溶液，４μＬＤＴＴ溶液，混匀后３７℃恒温水浴１ｈ；冷却至室温，加入２０μＬＩＡＡ溶液，避光静置３０ｍｉｎ，对半胱氨酸进行烷基化修饰；转移全部溶液至预先用碳酸氢铵溶液润湿的蛋白超滤管中，１４０００ｒ／ｍｉｎ４℃离心３０ｍｉｎ；加入１００μＬ碳酸氢铵溶液洗膜，１４０００ｒ／ｍｉｎ４℃离心３０ｍｉｎ，再重复两次；加入１００μＬ碳酸氢铵溶液于超滤管中，再加入１０μＬ胰蛋白酶溶液，混匀后３７℃恒温水浴酶解１２ｈ～１６ｈ；将酶反应物１４０００ｒ／ｍｉｎ４℃离心洗脱，再加入５０μＬ碳酸氢铵溶液洗脱，收集两次含特征肽段的洗脱液混匀待测。７．３．３ 仪器参考条件７．３．３．１ 液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下所示：ａ） 色谱柱：Ｃ１８柱（２．１ｍｍ×５０ｍｍ，１．７μｍ）或柱效相当者；ｂ） 流动相：梯度洗脱条件见表１；ｃ） 流动相流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ；ｄ） 色谱柱柱温：３０℃；ｅ） 样品室温度：４℃；ｆ） 进样体积：４μＬ。表１ 流动相梯度洗脱参考条件时间ｍｉｎ０．１％甲酸溶液（体积分数）％乙腈（体积分数）％０９５５０．５９５５３．５７０３０４．０１０９０４．７１０９０５．４９５５６．０９５５７．３．３．２ 质谱参考条件质谱参考条件如下：ａ） 离子化模式：电喷雾电离正离子扫描模式；ｂ） 质谱扫描方式：多反应监测（ＭＲＭ）；ｃ） 喷雾电压（ＩＳ）：５５００Ｖ；ｄ） 雾化气压力（ＧＳ１）：０．３７９ＭＰａ；ｅ） 辅助气压力（ＧＳ２）：０．３７９ＭＰａ；３犌犅／犜３８０８６—２０１９ｆ） 气帘气压力（ＣＵＲ）：０．２７６ＭＰａ；ｇ） 离子源温度：５５０℃；ｈ） 裂解电压（ＤＰ）：７０Ｖ；ｉ） 碰撞能量（ＣＥ）：３０ｅＶ；ｊ） ＭＲＭ的质谱参数：参见表２。表２ 犕犚犕的质谱参数名称母离子犿／狕子离子犿／狕金属硫蛋白特征肽段４９８．７８３６．４７６５．３６３７．３３６０．１３０７．１２３２．１ 注：“”为定量离子。７．３．４ 定性判定选择待测组分的１个母离子，６个子离子进行ＭＲＭ监控。在相同试验条件下，待测样液中待测物质的保留时间，与标准工作溶液的保留时间偏差在±２．５％之内，且待测样液中待测物定性离子的相对丰度与浓度接近的标准工作液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，最大允许偏差符合表３的规定，则可判定为试样中存在目标肽段。特征肽段的选择离子色谱图参见附录Ｂ。表３ 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度＞５０％＞２０％～５０％＞１０％～２０％≤１０％允许的最大偏差±２０％±２５％±３０％±５０％７．３．５ 标准曲线的制作将标准工作溶液依次注入液相色谱串联质谱仪，测定相应的峰面积。以标准工作溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。７．３．６ 试样的测定将待测样液注入液相色谱串联质谱仪，按照７．３．３确立的参考条件与参数，以４９８．７＞６３７．３为定量离子对测得的峰面积进行定量。７．３．７ 空白试验用１００μＬ碳酸氢铵溶液，按照７．３的步骤进行空白试验。７．３．８ 加标试验试样经过还原、烷基化修饰、洗涤除去ＤＴＴ和ＩＡＡ后，酶切前或者酶切后添加一定水平含量的特征肽段，进行加标回收试验，回收率参考范围为８０％～１２０％。４犌犅／犜３８０８６—２０１９８ 结果计算用式（１）计算试样中ＭＴⅠ和ＭＴⅡ的总含量：犡＝ρ×犞×犱×６．１６犿×１００…………………………（１） 式中：犡———试样中ＭＴⅠ和ＭＴⅡ的总含量，％；ρ———试样溶液中ＭＴⅠ和ＭＴⅡ特征肽段的质量浓度，单位为微克每升（μｇ／Ｌ）；犞———酶解溶液和洗脱溶液的总体积（１６０μＬ）；犱———试样溶液的总稀释倍数（８×２５）；犿———试样的质量，单位为克（ｇ）。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的平均值表示，结果保留两位有效数字。９ 精密度在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值，不得超过算术平均值的１５％。５犌犅／犜３８０８６—２０１９附 录 犃（规范性附录）合成的特征肽段物质信息犃．１ 合成的特征肽段物质技术要求合成的特征肽段物质技术要求应符合表Ａ．１的规定。表犃．１ 合成的特征肽段物质信息表序号名称英文名称要求１序列ＳｅｑｕｅｎｃｅＣ［ＣＡＭ］ＡＱＧＣ［ＣＡＭ］ＩＣ［ＣＡＭ］Ｋ２相对分子质量ＲｅｌａｔｉｖｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＷｅｉｇｈｔ９９５３纯度Ｐｕｒｉｔｙ＞９５％４外观Ａｐｐｅａｒａｎｃｅ白色粉末犃．２ 合成的特征肽段含量测定犃．２．１ 测定条件及典型色谱图犃．２．１．１ 测定条件仪器：高效液相色谱仪，配备紫外检测器；色谱柱：反相ＯＤＳ色谱柱，４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ；流动相Ａ：０．１％三氟乙酸乙腈溶液；流动相Ｂ：０．１％三氟乙酸水溶液；进样体积：２０μＬ；检测波长：２２０ｎｍ；流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；梯度洗脱见表Ａ．２。表犃．２ 梯度洗脱时间／ｍｉｎ流动相Ａ／％流动相Ｂ／％０．０７９３２５．０３２６８２５．１１０００３０．０停止犃．２．１．２ 合成的特征肽段典型色谱图合成的特征肽段用高效液相色谱测定，典型色谱图见图Ａ．１。６犌犅／犜３８０８６—２０１９图犃．１ 合成的特征肽段典型色谱图犃．２．２ 测定结果用高效液相色谱测定含量，采用面积归一化法进行定量。测定结果列于表Ａ．３。表犃．３ 测定结果出峰顺序出峰时间／ｍｉｎ峰面积浓度／％１１０．６６７９９６９．２１００．３１８５２１０．８０３３０５１７５３．５００９７．５１２１３１１．１９２３００１５．５５１０．９５９１４１１．７５３２７３７２．８２２０．８７４６５１４．３００１０５０５．１０４０．３３５７犃．３ 合成的特征肽段相对分子质量确证犃．３．１ 质谱条件仪器设备：液相色谱串联质谱仪；离子源：ＥＳＩ；扫描模式：正离子扫描；雾化气流速：１．５Ｌ／ｍｉｎ；离子源电压：４．５ｋＶ；７犌犅／犜３８０８６—２０１９加热模块温度：２００℃；ＣＤＬ温度：２５０℃；液相流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ；流动相：水∶乙腈＝１∶１。犃．３．２ 合成的特征肽段分子离子质谱图合成的特征肽段分子离子质谱图见图Ａ．２。图犃．２ 合成的特征肽段的分子离子质谱图根据质谱图可知，采用［Ｍ＋Ｈ］＋离子模式得到犿／狕为９９６．３５的合成特征肽段离子图，确证合成的特征肽段的相对分子质量为９９５。８犌犅／犜３８０８６—２０１９附 录 犅（资料性附录）犕犜Ⅰ和犕犜Ⅱ特征肽段的选择离子色谱图ＭＴⅠ和ＭＴⅡ特征肽段的选择离子色谱图见图Ｂ．１。图犅．１ 犕犜Ⅰ和犕犜Ⅱ特征肽段的选择离子色谱图９犌犅／犜３８０８６—２０１９