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中华人民共和国国家标准GB23748—2016食品安全国家标准辐照食品鉴定筛选法2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布GB23748—2016Ⅰ前言本标准代替GB/T23748—2009《辐照食品的鉴定DNA彗星试验法筛选法》、NY/T2214—2012《辐照食品鉴定光释光法》和SN/T2910.2—2011《出口辐照食品的鉴别方法第2部分:单细胞凝胶电泳法》。本标准与GB/T23748—2009相比,主要变化如下:———标准名称修改为“食品安全国家标准辐照食品鉴定筛选法”;———增加了两种筛选方法:光释光法和微生物学筛选法;———增加了DNA彗星试验法的限制性说明。GB23748—20161食品安全国家标准辐照食品鉴定筛选法1范围本标准规定了三种快速筛选食品是否接受过辐照的鉴定方法:光释光法、DNA彗星试验法和微生物学筛选法。本标准中的光释光法适用于甲壳类、香辛料和调味品类产品的辐照鉴定;DNA彗星试验法适用于动物产品、谷物、坚果、果蔬的辐照鉴定;微生物学筛选法适用于冷冻畜禽肉和水产品等各类生鲜食品的辐照鉴定。第一法光释光法2术语和定义2.1光释光(photostimulatedluminescence,PSL)富含硅酸盐类样品俘获的辐射能量经一定波长的光激发后,以光的形式释放出来的现象。2.2PSL强度(PSLintensity)样品经光激发后检测到的发光量,以光子计数率表示。2.3筛查PSL(screeningPSL)样品初次测量的PSL强度。2.4校正PSL(calibratedPSL)筛查PSL测量之后,同一样品用已知剂量辐照后测量的PSL强度。2.5阈值(thresholds)在筛查模式下,用于判定样品辐照与否的PSL强度,包括一个低阈值(T1)和一个高阈值(T2)。2.6阴性PSL(negativePSLresult)PSL测量强度低于低阈值。2.7可疑PSL(intermediatePSLresult)PSL测量强度在低阈值和高阈值之间。2.8阳性PSL(positivePSLresult)PSL测量强度高于高阈值。GB23748—201622.9空白对照(darkcount)无光刺激时,对空样品容器获得的光子计数率。2.10阳性对照(lightcount)将参考光源(比如装有14C的闪烁体或者等效物)置于样品容器中得到的光子计数率。3原理富含硅酸盐类物质的样品能够储存射线能量。通过一定波长的光再次激发照射,样品中储存的能量可以释放,产生光释放光信号。利用光释放光检测仪测试光信号的强度,比较不同光信号强度的大小,判定样品是否经过辐照。4仪器和设备4.1光释光测量系统:包括样品容器、光激发源、脉冲刺激仪和同步光子计数系统。4.2测量盘:直径5cm。4.3电离辐射源:对电离辐射源的使用和管理按GB17568和GB/T25306的规定。5分析步骤注:样品在测量前避光放置。测量时使用一次性测量盘。5.1香辛料和调味品的样品制备准备双份样品,均匀铺在测量盘底部,分别检测。如果两次检测结果与判定阈值相比不一致,则将样品4等分后重新进行检测,取其中最高的两个检测值作为结果进行判定,依此类推。5.2甲壳类动物的样品制备将带壳或去壳样品放入测量盘中,样品中带有动物肠子时有利于光释光信号的检测。如个体较大,可对样品切割;也可取肠子(不少于6根)放入测量盘中进行测量。5.3仪器设置设定辐照食品筛查系统的个体测量参数。检查空白对照和阳性对照。注:应当定期或者当测量出现阳性结果后,对容器进行空样品检测,检查仪器是否受到污染。5.4样品测定5.4.1筛查测量进行样品检测并记录结果。5.4.2校正测量筛查测量后的样品加盖保存,防止样品损失或污染。对这些样品再辐照特定剂量(香辛料和贝类食物辐照1kGy),辐照后室温(甲壳类动物和其他易腐烂样品应冷藏)避光保存12h,进行校正测量。GB23748—201636分析结果表述6.1阈值设定香料和调味品的阈值设定为:T1=700counts/min,T2=5000counts/min。甲壳类动物的阈值设定为:T1=1000counts/min,T2=4000counts/min。6.2结果判断根据与阈值的比较,样品测量结果可分为阴性、可疑、阳性三种情况,分别进行判定。6.2.1阴性结果6.2.1.1筛查PSL筛查PSL为阴性结果时,可判定样品未经辐照。6.2.1.2校正PSL校正PSL和筛查PSL同为阴性时,该样品不能被判定为辐照食品。若要进一步确认样品是否接受过辐照,应采用辐照食品鉴定的其他确证方法。校正PSL为阴性,但筛查PSL为阳性时,表明测量系统有错误,应当取新鲜的原始样品重新测量。6.2.2可疑结果6.2.2.1筛查PSL筛查PSL为可疑结果时,不能直接判定样品是否接受过辐照。6.2.2.2校正PSL校正PSL和筛查PSL同为可疑结果时,判定样品接受过辐照。校正PSL为可疑结果,筛查PSL为阴性结果时,表明样品可能是低敏感性未辐照食品。若要进一步确认样品是否接受过辐照,应采用辐照食品鉴定的其他确证方法。校正PSL为可疑结果,筛查PSL为高数值阳性结果时,表明测量有误。校正PSL为可疑结果,筛查PSL为接近T2的阳性结果时,表明样品可能接受过高于校正剂量的辐照。应当重新测量样品进行判定。6.2.3阳性结果6.2.3.1筛查PSL筛查PSL为阳性结果时,可判定样品接受过辐照。6.2.3.2校正PSL校正PSL和筛查PSL为同级别的阳性结果时,判定样品接受过辐照。校正PSL为阳性结果,且远高于阴性或可疑结果的筛查PSL时,表明样品可能未经辐照。校正PSL和筛查PSL为阳性结果,但校正PSL小于筛查PSL时(相差1到2个数量级),表明测量有误,需要重新进行测量。GB23748—20164第二法DNA彗星试验法7原理DNA分子经过辐照后会发生断裂。将细胞包埋在琼脂中,用裂解试剂溶解细胞膜,然后在一定的电压下进行电泳。受损的DNA片段在电场中向阳极方向快速移动,形成尾状分布。染色后,DNA受损的细胞就会出现彗星状电泳图谱,未受辐射的细胞图谱接近圆形或者轻微拖尾。8试剂除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的三级水。8.1二甲基亚砜(DMSO,C2H6OS)。8.2氯化钠(NaCl)。8.3氯化钾(KCl)。8.4磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)。8.5磷酸二氢钾(KH2PO4)。8.6乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA,C10H14N2O8Na2·2H2O)。8.7氢氧化钠(NaOH)。8.8三羟甲基氨基甲烷(Tris,C4H11NO3)。8.9硼酸(H3BO3)。8.10十二烷基磺酸钠(SDS,C12H25O4NaS)。8.11吖啶橙(C17H19N3·HCl·ZnCl2)。8.12溴化乙锭(C21H20BrN3)。8.13三氯乙酸(TCA,C2HCl3O2)。8.14硫酸锌(ZnSO4)。8.15甘油(C3H8O3)。8.16碳酸钠(Na2CO3)。8.17硝酸铵(NH4NO3)。8.18硝酸银(AgNO3)。8.19钨硅酸(H4[Si(W3O10)4]·xH2O)。8.20甲醛(CH2O)。8.21冰乙酸(CH3COOH)。8.22磺化吡啶(C10H12O4N2S)。8.23琼脂糖。8.24低熔点琼脂糖。9试剂配制试验中所用的试剂配制见附录A。GB23748—2016510仪器和设备10.1水平电泳槽。10.2电子天平:感量为0.1g。10.3电加热磁力搅拌器。10.4微波炉。10.5微孔滤膜:孔径100μm、200μm、500μm。10.6显微镜载玻片:76mm×26mm,带磨砂边。10.7荧光显微镜:100倍~400倍;蓝色激发波长460nm~485nm,用于吖啶橙染色观察;绿色激发波长515nm~560nm,用于磺化吡啶或溴化乙锭染色观察。11分析步骤11.1样品制备11.1.1动物组织11.1.1.1骨髓样品制备切开骨头,称取约50mg骨髓置于试管中,加入3mL冰预冷的PBS缓冲液。用玻璃棒搅拌,将细胞悬起,用100μm的微孔滤膜过滤细胞悬液,收集滤液并将滤液置于冰盒上,备用(细胞悬液可置于冰上放置,时间不超过10min;在加入5%~10%的DMSO作为防冻剂后,细胞可置于-20℃保存26h)。11.1.1.2肌肉组织样品制备用解剖刀将肌肉组织切成薄片(不能有可见脂肪)。称取1g肌肉置于小烧杯中,加入5mL冰预冷的PBS缓冲液。将该烧杯置于冰盒中,玻璃棒搅拌5min,依次用500μm和200μm的微孔滤膜过滤,收集滤液并在冰盒上放置5min,备用。11.1.2植物组织11.1.2.1原粮、坚果和调味料等食品称取样品0.25g,用研钵碾碎,置于小烧杯中,加入3mL冰预冷的PBS缓冲液。将该烧杯置于冰盒中,用玻璃棒搅拌5min,依次用500μm和200μm的微孔滤膜过滤,收集滤液并在冰盒上放置15min~60min,备用。11.1.2.2草莓等浆果称取0.25g草莓浆果,用研钵碾碎,置于小烧杯中,加入3mL冰预冷的PBS缓冲液。将该烧杯置于冰盒中,用玻璃棒搅拌5min,依次用500μm和200μm的微孔滤膜过滤,收集滤液并在冰盒上放置15min~60min,备用。11.1.2.3蔬菜(不包括食用菌)将蔬菜的可食部分用解剖刀切成薄片,取4g,加入5mL冰预冷的PBS缓冲液,用研钵碾碎,置于小烧杯中,加入3mL冰预冷的PBS。将该小烧杯置于冰盒中,玻璃棒搅拌5min,依次用500μm和200μm的微孔滤膜过滤,收集滤液并在冰盒上放置15min~60min,备用。GB23748—2016611.2预涂载玻片涂布前,应将载玻片用甲醇浸泡以除去表面油脂。风干后,滴一滴(约50μL)涂层琼脂糖溶液于载玻片上,立即取另一个载玻片盖在琼脂糖上,使琼脂糖溶液散开,取下上层载玻片,风干30min,待用。11.3包埋凝胶取100μL细胞悬液与1mL包埋凝胶溶液混匀,然后取100μL该混合液用微量移液器的吸头轻轻涂布在预涂载玻片上,立即盖上盖玻片使凝胶铺展均匀,注意不可产生气泡。将载玻片置于冰盒上5min,然后用解剖刀尖将盖玻片从琼脂糖上剥离。11.4溶解细胞将11.3制备的载玻片完全浸入裂解缓冲液中(动物细胞≥5min,植物细胞≥15min),使细胞溶解,溶解过程不要碰触琼脂糖。11.5回湿将载玻片浸入电泳缓冲液中,时间5min。11.6电泳将载玻片并排放入水平电泳槽,磨砂边缘朝向阴极。电泳槽中加入电泳缓冲液没过载玻片2mm~4mm。室温下电泳20min,电压2V/cm。关闭电源后,将载玻片放入水中5min,室温下风干1h。11.7染色11.7.1吖啶橙、磺化吡啶或溴化乙锭染色将载玻片浸入染色液(吖啶橙染色液、磺化吡啶染色液或溴化乙锭染色液)3min~5min,然后浸入水中清洗0.5min~1min,擦干载玻片下多余的水分,荧光显微镜观察。11.7.2硝酸银染色将载玻片置于混合液A10min,水洗1min,40℃~50℃恒温干燥箱干燥1h或室温风干。然后将载玻片浸入混合液D10min~20min,重复该步骤1次~2次,染色时间5min~10min,直至载玻片呈现棕色。水洗1min,用停止液E浸泡5min停止染色反应,再水洗1min。最后将载玻片室温放置,自然风干。染色后的载玻片不会褪色,可长期保存观察。注:荧光染料易淬灭,染色要迅速;染色液有毒,试验结束后,应对废液进行净化处理再行弃置。11.8观察鉴别11.8.1荧光观察吖啶橙染色的载玻片应用荧光显微镜(460nm~485nm,蓝光激发)观察,染色DNA发出绿色荧光。磺化吡啶或溴化乙锭染色的载玻片应用荧光显微镜(515nm~560nm,绿色激发)配合590nm滤光片观察,染色DNA发出红色荧光。11.8.2白光观察硝酸银染色的载玻片可使用普通显微镜观察。GB23748—2016712分析结果的表述12.1结果表述通过显微镜观察,辐照过的样品