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中华人民共和国国家标准GB5413.15—2010中华人民共和国卫生部发布2010-03-26发布2010-06-01实施食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定NationalfoodsafetystandardDeterminationofvitaminniacinandniacinamideinfoodsforinfantsandyoungchildren,milkandmilkproductsGB5413.15—2010I前言本标准第二法等同采用国际分析家学会（AOAC）944.13NiacinandNiacinamide(NicotinicAcidandNicotinamide)inVitaminPreparations。本标准代替GB/T5413.15-1997《婴幼儿配方食品和乳粉烟酸和烟酰胺的测定》。本标准第二法与GB5413.15-1997相比，主要变化如下：——增加了光密度法测定；——增加了淀粉类试样的测定；——增加标准曲线绘制的文字描述。本标准附录A为资料性附录。本标准代替标准的历次版本发布情况为：——GB5413-1985、GB/T5413.15-1997。GB5413.15—20101食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定1范围本标准规定了婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定方法。本标准适用于婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定。2规范性引用性文件本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其昀新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。第一法高效液相色谱法3原理试样经热水提取、酸性沉淀蛋白质后，以C18色谱柱分离，用紫外检测器定量。4试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1淀粉酶：酶活力≥1.5U/mg。4.2盐酸。4.3氢氧化钠。4.4盐酸(2.4mol/L)：准确移取10mL盐酸（4.2）于50mL容量瓶中，用水定容。4.5氢氧化钠溶液（2.5mol/L）：称取5.0g氢氧化钠（4.3）于50mL容量瓶中，用水定容。4.6高氯酸（HClO4）：体积分数为60%。4.7甲醇（CH4O）：色谱纯。4.8异丙醇(C3H8O)：色谱纯。4.9庚烷磺酸钠(C7H15NaO3S)：优级纯。4.10标准溶液4.10.1烟酸及烟酰胺标准储备液（1.0mg/mL）：称取烟酸及烟酰胺标准品各0.1g（精确到0.0001g），分别置于100mL容量瓶中，用水溶解定容。4.10.2烟酸及烟酰胺混合标准中间液（40µg/mL）：分别准确吸取烟酸及烟酰胺标准储备液（4.10.1）2mL至50mL定量瓶中，用水定容。临用前配制。GB5413.15—201024.10.3烟酸及烟酰胺混合标准系列测定液：分别准确吸取烟酸及烟酰胺混合标准中间液（4.10.2）0.0mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL、10.0mL，至50mL容量瓶中用水定容。该标准系列浓度分别为0.00µg/mL、0.80µg/mL、1.60µg/mL、4.00µg/mL、8.00µg/mL。临用前配制。5仪器和设备5.1高效液相色谱仪，带紫外检测器。5.2pH计：精度为0.01。5.3超声波振荡器。5.4天平：感量为0.1mg。5.5培养箱：30℃～80℃。6分析步骤6.1试样的预处理6.1.1含淀粉的试样：称取混合均匀固体试样约5.0g（精确到0.0001g）加入约25mL45℃～50℃的水，或称取混合均匀液体试样约20.0g（精确到0.0001g）于150mL锥形瓶中，再加入约0.5g淀粉酶（4.1），摇匀后向锥形瓶中充氮，盖上瓶塞，置于50℃～60℃的培养箱内培养约30min，取出冷却至室温。6.1.2不含淀粉的试样：称取混合均匀固体试样约5.0g（精确到0.0001g）加入约25mL45℃～50℃的水，或称取混合均匀液体试样约20.0g（精确到0.0001g）于150mL锥形瓶中，振摇，静置5min～10min，充分溶解，并冷却至室温。6.1.3提取：将上述锥形瓶置于超声波振荡器中振荡约10min。6.1.4沉淀及定容：待试样溶液降至室温后，用盐酸（4.4）调节试样溶液的pH值至1.7±0.1，放置约2min后，再用氢氧化钠溶液（4.5）调节试样溶液的pH值至4.5±0.1。将试样溶液转至50mL容量瓶中，用水反复冲洗锥形瓶，洗液合并于50mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀后经滤纸过滤，滤液再经0.45μm微孔滤膜加压过滤，用试管收集，即为试样待测液。6.2参考色谱条件色谱柱：C18柱（粒径5μm，150mm×4.6mm）或具有同等性能的色谱柱。流动相：甲醇（4.7）70mL，异丙醇（4.8）20mL，庚烷磺酸钠（4.9）1g，用910mL水溶解并混匀后，用高氯酸（4.6）调pH至2.1±0.1，经0.45μm膜过滤。流速：1.0mL/min。检测波长：261nm。柱温：25℃。进样量：10μL。6.3定量分析6.3.1标准曲线绘制将烟酸及烟酰胺混合标准系列测定液（4.10.3）依次进行色谱测定（其标准样品色谱图参见附录A中图A.1.1）。记录各组分的色谱峰面积或峰高，以峰面积或峰高为纵坐标，以标准测定液的浓度为横坐标，绘制标准曲线。GB5413.15—201036.3.2试样测定将试样待测液（6.1.4）进行色谱测定。记录各组分色谱峰面积或峰高，根据标准曲线计算出试样待测液中烟酸及烟酰胺各组分的浓度ci。7分析结果的表述7.1试样中烟酸或烟酰胺含量的计算试样中烟酸或烟酰胺的含量按（1）式计算：mVcXi10021××=或………………………………………………………………（1）式中：X1或2——试样中烟酸或烟酰胺的含量，单位为微克每百克（μg/100g）；m——试样的质量，单位为克（g）；ci——试样待测液中烟酸或烟酰胺的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V——试样溶液的体积，单位为毫升（mL）。7.2试样中维生素PP总含量的计算试样中维生素PP的总含量按（2）式计算：X＝12XX+……………………………………………………………………………（2）式中：X——试样中维生素PP的总含量，单位为微克每百克（μg/100g）；X1——试样中烟酸的含量，单位为微克每百克（μg/100g）；X2——试样中烟酰胺的含量，单位为微克每百克（μg/100g）。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。8精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。第二法微生物法9原理利用植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）ATCC8014对烟酸和烟酰胺的特异性，在含有烟酸和烟酰胺的样品中生长产生的酸度和形成的光密度来测定烟酸和烟酰胺的含量。10试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。10.1硫酸溶液A（10mol/L）：将质量分数为95%～98%的浓硫酸560mL缓慢加入到600mL水中，边加边搅拌，冷却后定容至1000mL。GB5413.15—2010410.2硫酸溶液B（1mol/L）：吸取100mL10mol/L的硫酸溶液A（10.1），转移至1000mL容量瓶用水定容。10.3氢氧化钠溶液A（3.75mol/L）：称取150g氢氧化钠于1000mL烧杯中，用400mL水溶解，冷却至室温后，转移至1000mL容量瓶中，用水定容。10.4氢氧化钠溶液B（0.375mol/L）：吸取100mL氢氧化钠溶液A（10.3）转移至1000mL容量瓶用水定容。10.5氢氧化钠标准滴定溶液（0.1mol/L±0.0002mol/L）：称取4g（精确至0.0001g）氢氧化钠用水稀释至1000mL，用邻苯二甲酸氢钾标定。保存此溶液的容器要密封，以防二氧化碳渗透。10.5.1氢氧化钠标准溶液的标定：称取约0.18g（精确至0.0001g）于105℃～110℃烘至恒重的邻苯二甲酸氢钾，用50mL除二氧化碳的水溶于锥形瓶中，加两滴5g/L的酚酞指示剂，用配好的氢氧化钠溶液滴定至粉红色，同时作空白实验。氢氧化钠标准溶液的浓度为：c=2042.0)(m21×−VV……………………………………………………………(3)式中：c——氢氧化钠的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）；m——邻苯二甲酸氢钾的质量，单位为克（g）；V1——氢氧化钠溶液的用量，单位为毫升（mL）；V2——空白试验氢氧化钠溶液的用量，单位为毫升（mL）。10.5.2酚酞溶液：称取0.5g酚酞溶于75mL体积分数为95%的乙醇中，并加入20mL水，加入氢氧化钠标准滴定溶液（10.5），直至加入一滴立即变成粉红色，再加入水定容至100mL。10.6盐酸（0.1mol/L）：吸取8.3mL盐酸，用水稀释至1000mL。10.7乙醇溶液：体积分数为25%。量取250mL无水乙醇，加入750mL水，混匀。10.8菌株：植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）ATCC8014。10.9培养基（或可使用商品化的合成培养基）10.9.1乳酸杆菌琼脂培养基：光解胨15g，葡萄糖10g，番茄汁100mL，磷酸二氢钾2g，聚山梨糖单油酸酯1g，琼脂10g，加蒸馏水至1000mL，pH6.8±0.2（20℃～25℃）。121℃高压灭菌15min，备用。10.9.2乳酸杆菌肉汤培养基：光解胨15g，葡萄糖10g，番茄汁100mL，磷酸二氢钾2g，聚山梨糖单油酸酯1g，加蒸馏水至1000mL，pH6.8±0.2（20℃～25℃）。121℃高压灭菌15min，备用。10.9.3烟酸测定用培养基：维生素测定用CasaminoAcids12g，葡萄糖40g，乙酸钠20g，L-胱氨酸0.4g，DL-色氨酸0.2g，盐酸腺嘌呤20mg，盐酸鸟嘌呤20mg，尿嘧啶20mg，盐酸硫胺素200μg，泛酸钙200μg，盐酸吡哆醇400μg，核黄素400μg，p-氨基苯甲酸100μg，生物素0.8μg，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.4g，氯化钠20mg，硫酸亚铁20mg，硫酸锰20mg。加蒸馏水至1000mL，调pH至6.7±0.2（20℃～25℃）。10.10标准溶液GB5413.15—2010510.10.1烟酸标准贮备液（100μg/mL）：在五氧化二磷干燥器中取出已干燥的烟酸标准品，称取50.0mg(精确至0.1mg)，用乙醇溶液（10.7）溶解并定容至500mL，2℃～4℃冰箱冷藏，保存期为4个月。10.10.2烟酸标准中间溶液（10μg/mL）：从烟酸标准贮备液（10.10.1）中吸取10mL至100mL容量瓶，用乙醇溶液（10.7）定容，2℃～4℃冰箱冷藏，保存期为1个月。10.10.3烟酸标准工作液（100ng/mL）：从标准中间液（10.10.2）中吸取5.0mL，用水稀释至500mL。临用前配制。10.110.9%生理盐水：称0.9g氯化钠于100mL容量瓶中，稀释至刻度，振荡溶解。分装于具塞试管中，每管10mL，121℃灭菌15min，每周准备一次。10.12溴麝香草酚蓝指示剂：称取0.1g溴麝香草酚蓝于研钵中，加入1.6mL氢氧化钠标准滴定溶液（10.5）研磨，加少许水至完全溶解，转移至250mL容量瓶中用水定容。11仪器和设备11.1分光光度仪。11.2pH计：精度为0.01。11.3涡旋振荡器。11.4天平：感量为0.1mg。11.5生化培养箱：36℃±1℃。11.6离心机：转速≥2000转/分钟。11.7滴定管：分刻度值为0.1mL。12分析步骤12.1测试菌液的制备12.1.1把植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）ATCC8014冻干菌粉转入乳酸杆菌肉汤培养基（10.9.2）试管中，36℃±1℃培养24h，转接至乳酸杆菌琼脂培养基（10.9.1）试管中，36℃±1℃再培养24h。培养好的乳酸杆菌琼脂培养