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ICS11.020CCSC50中华人民共和国卫生行业标准WS/T785—2021WS人类白细胞抗原基因分型检测体系技术标准Technicalstandardforhumanleukocyteantigen(HLA)genotyping2021-08-27发布2022-01-01实施中华人民共和国国家卫生健康委员会 发布WS/T785—2021I前言本标准由国家卫生健康标准委员会临床检验标准专业委员会负责技术审查和技术咨询，由国家卫生健康委医管中心负责协调性和格式审查，由国家卫生健康委医政医管局负责业务管理、法规司负责统筹管理。本标准起草单位：北京医院、北京市红十字血液中心、中华骨髓库管理中心、浙江省血液中心、辽宁省血液中心。本标准主要起草人：蔡剑平、张志欣、肖尧、黑爱莲、周晓阳、王琳、戴大鹏、张立群、朱发明、李剑平。WS/T785—2021II引言人类白细胞抗原（humanleukocyteantigen,HLA）又称移植抗原，与同种异体组织器官移植以及移植物的排斥反应相关。存在于细胞膜表面的HLA分子可以结合来自细胞内或细胞外的肽，形成HLA-肽复合物，抗原递呈细胞将该复合物递呈给T细胞引起一系列的免疫反应。随着对HLA研究的深入，20世纪中叶诞生的器官移植和造血干细胞移植技术已成为临床医学治疗和拯救患者生命的重要手段，数以百万计的患者通过器官移植和造血干细胞移植获得了新生。近二十年来，随着对免疫抑制剂、HLA配型、HLA抗体检测和监测等存活率影响因素的认识，器官移植和造血干细胞移植存活率得到了显著的改善。HLA组织配型是影响器官移植和造血干细胞移植存活率及受者生存质量的重要因素之一。HLA基因具有高度的多态性，决定了所表达的HLA抗原分子的多态性。随着聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)技术在临床应用的日益广泛，从20世纪80年代末开始HLA分型已从过去主要采用血清学和细胞学检测技术过渡到以基因分型检测技术为主。基因分型检测技术具有灵敏度高、准确度高、能检测出血清学和细胞学方法无法检出的基因型别等优点，还具有不排斥原有血清学和细胞学所阐述信息的优点。HLA基因分型检测技术对实验室人员、实验室设置、检测的技术流程以及质量控制等提出了更高的要求。长期以来我国一直缺乏HLA基因分型检测技术体系的规范及要求，在一定程度上影响了HLA基因分型整体检测水平的提高和临床器官移植、造血干细胞移植标准化的进程。本标准拟建立适用于我国国情的HLA基因分型检测技术体系的规范及要求，旨在提高我国HLA基因分型实验室的技术水平，更有效地服务于与HLA相关的临床诊疗工作。WS/T785—20211人类白细胞抗原基因分型检测体系技术标准1范围本标准规定了HLA基因分型检测体系的技术要求。本标准适用于所有开展人体标本HLA基因分型检测，提供与临床疾病的诊疗、预防、用药监测或者移植以及人体健康评估相关报告的检测实验室，也适用于开展捐献者HLA基因分型数据入库的检测实验室和对HLA检测进行质量控制的实验室。2规范性引用文件本标准没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1IPD-IMGT/HLA数据库Immuno-PolymorphismDatabase(IPD)-internationalImMunoGeneTicsproject(IMGT)/HLAdatabase人类主要组织相容性复合物的DNA序列数据库，包含经世界卫生组织HLA命名委员会命名的HLA等位基因序列。3.2基于直接测序的基因分型sequencebasedtyping,SBT基于核酸直接测序技术的基因分型方法。3.3基于序列特异性引物的基因分型sequence-specificprimer,SSP采用等位基因特异性引物进行核酸扩增的基因分型方法。3.4基于序列特异性寡核苷酸杂交的基因分型sequence-specificoligonucleotide,SSO采用特异性序列的寡核苷酸进行核酸杂交的基因分型方法。3.5基因型genotype某一基因或一组基因的具体等位基因组合。3.6基因座locus基因在染色体上的位置，同一座位上可能有不同类型的等位基因；或一段DNA序列在染色体上的位置。3.7擦拭检测wipetestWS/T785—20212是一种通过擦拭物体表面来监测实验室设备和台面是否被核酸污染的检测方法。4环境和设施要求4.1环境4.1.1实验室应有充足的空间，以便所有操作过程和检测分析能够正常运行，区域间应避免相互干扰。4.1.2实验室检测区域应分为“清洁区”和“污染区”，进行有效隔离并采取措施以防止核酸交叉污染。4.1.3应对实验室环境温度、湿度进行监控并记录。4.2设施4.2.1存放试剂和标本的冰箱或者冰柜应满足实验的需要。4.2.2照明和通风设备及紧急喷淋、洗眼器等应急设备应与实验检测要求相适应。4.2.3保存记录的设施应满足档案管理要求。使用中的记录和存档记录的保存位置清晰可辨且易于查找。4.2.4需要控制温度的仪器应根据实验要求调节到最佳温度，定期对其温度进行监控和记录。4.2.5关键仪器设备应配置无间断电源。4.2.6设备应由经过授权的人员操作，专人管理。4.2.7设备及其软件应有唯一性标识，并保存记录。4.2.8仪器设备应定期进行维护保养，并保存维护、维修记录。4.2.9应根据需求变化或硬件环境的变化对应用程序进行部分或全部的升级，并对升级后的软件进行性能评估。依据IPD-IMGT/HLA数据库的更新，至少每年一次对本地HLA数据库进行更新，并针对更新后的数据库进行性能评估。4.3生物、化学和物理危险性4.3.1生物危险性所有人类标本（包括血样、组织等）均应被认作感染性的样本来处置，实验室应根据检测工作进行相应的生物安全等级备案。4.3.2化学危险性分子生物学实验过程可能使用含有毒性的或致突变的化学物质（如氯仿、溴化乙啶和苯酚），每一种化学品的使用应遵循我国对化学品使用的相关规定。4.3.3物理危险性分子生物学实验过程可能遇到具有潜在的物理危险性（如电泳仪、紫外线及离心设备），应遵循相应仪器的操作规则。5试剂耗材的采购和储存5.1通用要求5.1.1应制定并执行检测试剂、耗材的选择、购买、接收和储存的程序。5.1.2购买的检测试剂、耗材，验收合格后方可使用并保留验收记录。5.1.3应对影响检测质量的关键耗材、试剂供应商进行评价，保存评价记录和供应商名录。5.2试剂耗材评估5.2.1选购影响检测质量的关键耗材、试剂前应进行评估，产品质量应满足实验室检测要求。5.2.2更换试剂和耗材的生产商应进行评估，产品质量应满足实验室检测要求。5.2.3使用新批号试剂前，应对新、旧批号质量进行比对。可采用平行检测同一样本或质控品的方式，新批号质量应满足实验室检测要求。WS/T785—202135.2.4影响检测质量的关键耗材、试剂应确认合格，经实验室主任或者授权人审批后才投入使用。5.3试剂的来源、制备及储存5.3.1应记录影响检测质量的关键耗材和试剂的来源，包括制造商、供应商、购买日期、购买人、试剂批号等，且易于查询。5.3.2所有检测试剂应使用等级匹配的化学试剂配制，保证检测试剂达到分子生物学等级水准。5.3.3应按照实验室标准操作规程进行试剂配制，并进行记录。5.3.4所有使用的试剂应清晰标记名称、浓度、试剂特性、无菌状态、试剂保存条件、配制人、配制日期或开启日期、试剂有效期，并清晰标示试剂毒性。5.3.5所有使用的商业试剂的储存标准应与制造商提供的说明书相一致。5.3.6商业或者自制的试剂、水、溶液、培养基、质控品、校准品及其他试剂，当超过使用效期、性质改变或质量下降时，不应使用。5.3.7使用商业试剂盒应遵循制造商的说明书。5.3.8应记录每次检测使用试剂的批号或者货号。6样本的采集和处理6.1患者或被检测者信息6.1.1患者或被检测者的送检单信息内容应包括姓名、性别、出生日期（年龄）、采样日期、样本类型、送检医师姓名、临床相关资料或实验室检查资料，可酌情调整内容。6.1.2样本容器上应标注唯一性标识。6.1.3患者或被检测者信息表、样本、验收记录应归档保存，便于分析和追溯。6.1.4实验室应确保患者或被检测者信息的安全性和保密性。6.1.5患者或被检测者的样本被用于科研项目或商业项目时，应经过伦理审查和知情同意；如患者或被检测者样本仅进行临床检测，则无需填写知情同意书。6.2样本采集6.2.1样本采集前应明确采集方法、采集部位和保存方式，准备好采集器械。采集样本类型可为外周血、口腔拭子、骨髓细胞、唾液、组织。6.2.2样本采集应按照实验室操作标准进行操作，并进行记录。6.2.3采集样本时应注意影响样本采集和质量的因素，外周血推荐使用EDTA等抗凝剂，不宜使用肝素抗凝。6.2.4采集的样本应具有唯一性标识，并与送检单一一对应，可追溯患者姓名、出生日期、医院编号或者实验室编号、样本采集日期和采集时间。6.3样本运输6.3.1样本可以常温或普通冰袋运输，防止反复冻融和污染。6.3.2样本应有运输清单信息，包括样本编号、采集时间、采集实验室、采集人、样本数量、患者信息、运输容器、运输方式和保存方式等。6.4样本接收和验收6.4.1接收样本时，应做好接收验收记录，包括样本来源、类型、运输方法、运输容器、实验室接收样本的日期、样本质量和数量、附带资料等。6.4.2当样本信息不足、样本处理或运输不当、量不能满足检测、抗凝方式不当，实验室可以拒收样本并做好相应记录，通知送检方重新送检。6.4.3验收通过的样本应按实验要求进行编号并存储样本信息。6.4.4采集后的样本可于4℃暂存2周，超出2周宜在-20℃以下冰箱保存。样本应避免反复冻融和相互污染，尽早提取核酸。6.5样本基因组DNA提取、检测和保存WS/T785—202146.5.1样本基因组DNA提取6.5.1.1可从多种类型的样本中提取基因组DNA，提取方法应已获得广泛认可，并经实验室验证。6.5.1.2提取DNA时应记录所有操作步骤及试剂来源，操作步骤及试剂来源的任何变动或实验过程中的任何异常现象也应记录，操作人应签字并注明实验日期。6.5.1.3应设有独立的DNA提取操作区。操作区照明和通风设备应满足实验要求，关键设备配置无中断或紧急电源，并利用物理或生化手段防止污染。区域内使用专用工作服、手套和一次性用品。6.5.1.4DNA提取前应验证所有试剂质量以及DNA提取系统。应按照标准操作规程提取DNA，操作手册置于便于取阅的地方。6.5.1.5应保留部分原始样本，不应全部用来提取DNA，以便后续追溯和使用。6.5.1.6DNA提取完成后应填写提取记录，包括样本编号、提取时间、提取操作人、提取方式、样本浓度和体积等。6.5.2DNA浓度的测定6.5.2.1对于要求高纯度核酸的检测方法，应对获取的DNA进行浓度和纯度的检测，可使用分光光度计法和电泳法。6.5.2.2分光光度计对DNA浓度测定前应先校正，并设立合适的对照。DNA样本被检测时，应保证其全部溶解且浓度均匀。核酸最大吸收波长在260nm，1.0的光密度值相当于双链DNA含量为50μg/mL；蛋白质最大吸收波长在280nm处，因此测定A260/A280比值，可判断样本中蛋白质和RNA污染的情况。比值在1.8～2.0之间，说明DNA纯度高；比值小于1.6，说明样本中蛋白质残留较多；如果比值大于2.0，可能样本有RNA污染，建议重新抽提或纯化。6.5.2.3电泳法常用来判断DNA的完整性和RNA污染情况。6.5.2.4DNA浓度、纯度和完整性应符合实验室使用试剂的要求。若不符合后续检测的要求，应重新抽提。6.5.3基因组DNA的保存基因组DNA可于4℃暂存2周，超出2周宜在-20℃以下冰箱保存。-20℃保存超过1年后再使用，应先进行DNA质量评估，满足实验要求方可使用。7HLA基因分型检测方法7.1聚合酶链反应-序列特异性引物（polymerasechainreaction-sequencespecificprime