WS∕T 683-2020 消毒试验用微生物要求

ICS11.080C50WS中华人民共和国卫生行业标准WS/T683—2020消毒试验用微生物要求Requirementsofmicroorganismfordisinfectiontest2020-07-20发布2021-02-01实施中华人民共和国国家卫生健康委员会发布WS/T683—2020I前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、江苏省疾病预防控制中心、中国人民解放军疾病预防控制中心、北京市疾病预防控制中心、山东省疾病预防控制中心、黑龙江省疾病预防控制中心、广州海关技术中心。本标准主要起草人：沈瑾、段弘扬、王林、张流波、徐燕、魏秋华、王佳奇、佟颖、崔树玉、李涛、李炎、林玲、吴晓松、于礼、孙惠惠、廖如燕、杨彬、韩杰、李俐、朱亭亭。WS/T683—20201消毒试验用微生物要求1范围本标准规定了消毒试验微生物、培养基、传代与保存、菌悬液和染菌载体制备的要求。本标准所指消毒试验用微生物仅包括细菌、真菌、分枝杆菌和细菌芽胞，不涉及消毒试验用病毒及其他微生物的替代物（如酶、抗原、核酸等）。本标准适用于各种消毒试验用微生物（除病毒和替代物外）的使用和保存。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB18281.5医疗保健产品灭菌生物指示物第5部分：低温蒸汽甲醛灭菌用生物指示物GB/T33417过氧化氢气体灭菌生物指示物检验方法GB/T33419环氧乙烷灭菌生物指示物检验方法GB/T33420压力蒸汽灭菌生物指示物检验方法消毒技术规范（2002年版）卫生部（卫法监发〔2002〕282号）3试验微生物3.1来源试验微生物来源于具有资质的菌种保藏机构，并能通过常规检测方法进行鉴定。3.2细菌3.2.1金黄色葡萄球菌消毒试验以金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)作为细菌繁殖体中化脓性球菌的代表，试验常用菌种为ATCC6538；消毒剂对皮肤消毒模拟现场试验时，用ATCC27217。3.2.2大肠杆菌消毒试验以大肠杆菌(Escherichiacoli)作为细菌繁殖体中肠道菌的代表，试验常用菌种为8099；消毒剂对手消毒模拟现场试验时，用8099或NCTC10538。3.2.3铜绿假单胞菌消毒试验以铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)作为医院感染中最常分离的细菌繁殖体的代表，试验菌种为ATCC15442。3.2.4白色葡萄球菌WS/T683—20202消毒试验以白色葡萄球菌(Staphylococcusalbus)作为空气中细菌的代表，试验菌种为8032。3.3真菌3.3.1白色念珠菌消毒试验以白色念珠菌(Candidaalbicans)作为致病性真菌的代表，试验常用菌种为ATCC10231。3.3.2黑曲霉菌消毒试验以黑曲霉菌(Aspergillusniger)作为致病性真菌的代表，试验常用菌种为ATCC16404。3.4分枝杆菌消毒试验以龟分枝杆菌脓肿亚种(Mycobacteriumchelonaesubsp.abscessus)、鸟分枝杆菌（Mycobacteriumaviumsubsp.avium）或地分枝杆菌（Mycobacteriumterrae）作为人结核分枝杆菌的代表，试验用菌种为龟分枝杆菌脓肿亚种CMCC（B）93326或ATCC19977，鸟分枝杆菌ATCC15769，地分枝杆菌ATCC15755。3.5细菌芽胞3.5.1枯草杆菌黑色变种芽胞消毒试验以枯草杆菌黑色变种芽胞（Bacillussubtilisvar.niger）作为细菌芽胞的代表，试验常用菌种为ATCC9372；用于指示干热灭菌效果时，符合《消毒技术规范》（2002年版）的要求；用于指示环氧乙烷灭菌效果时，符合GB/T33419的要求。3.5.2嗜热脂肪杆菌芽胞嗜热脂肪杆菌芽胞（Geobacillusstearothermophilus）是灭菌效果指示菌，菌种为ATCC7953或SSIK31；用于指示压力蒸汽灭菌效果时，符合GB/T33420的要求；用于指示过氧化氢气体灭菌效果时，符合GB/T33417的要求；用于指示低温蒸汽甲醛灭菌效果时，符合GB18281.5的要求。3.5.3短小杆菌芽胞短小杆菌芽胞（Bacilluspumilus）是电离辐射灭菌或消毒的指示菌，菌种为E601或ATCC27142，符合《消毒技术规范》（2002年版）的要求。3.6其他可根据消毒试验要求，选择抗力相当的其他菌种进行试验。4培养基4.1选择相应培养基和试剂进行菌种的传代和培养，消毒试验所需培养基和试剂见附录A。4.2实验室自行制备的固体斜面培养基和平板冷藏保存，保存期不超过3个月，如出现缺水、干裂等情况，灭菌处理后销毁。实验室自行制备的液体培养基密封冷藏保存，保存期不超过3个月，如出现浑浊，灭菌处理后销毁。4.3商品化平板、斜面和培养基按产品说明书储存并在有效期内使用。5传代与保存WS/T683—202035.1复苏与传代5.1.1以无菌操作方式开启冻干菌种管，加入适量培养液（按菌种选择培养液，如细菌选择营养肉汤、白色念珠菌选择沙堡液体培养基、分枝杆菌选择苏通综合液体培养基、黑曲霉菌选择麦芽浸膏营养肉汤培养基），吹吸数次，使菌种融化分散。取含5.0mL～10.0mL相应培养液的试管，滴入少许菌种悬液，在适宜温度下培养至规定时间（一般为36℃±1℃培养18h～24h、黑曲霉菌为30℃±1℃培养42h～48h），此为第1代培养物。5.1.2用接种环取第1代培养物，或从菌种冻存管中取适量菌液/瓷珠，划线接种于相应培养基平板（按菌种选择培养基，如细菌选择营养琼脂培养基、白色念珠菌选择沙堡琼脂培养基、分枝杆菌选择改良罗氏培养基或其他商品化分枝杆菌专用复合琼脂培养基、黑曲霉菌选择麦芽浸膏琼脂培养基），在适宜温度下培养至规定时间（一般为36℃±1℃培养18h～24h、分枝杆菌36℃±1℃培养72h、黑曲霉菌30℃±1℃培养42h～48h），此为第2代培养物。5.1.3挑取第2代培养物中典型菌落，接种于相应培养基斜面或平板（按菌种选择培养基斜面，如细菌选择营养琼脂斜面、白色念珠菌选择沙堡琼脂斜面、分枝杆菌选择改良罗氏培养基或其他商品化分枝杆菌专用复合琼脂斜面、黑曲霉菌选择麦芽浸膏琼脂培养基平板），在适宜温度下培养至规定时间（一般为36℃±1℃培养18h～24h、分枝杆菌36℃±1℃培养72h、黑曲霉菌30℃±1℃培养42h～48h），此为第3代培养物。5.1.4取第3代培养物，接种于相应培养基斜面，在适宜温度下培养至规定时间，此为第4代培养物。5.1.5按上述方法培养至所需代数，传代时在试管上注明菌种名称、菌种号、代数及传代日期等基本信息。5.2保存5.2.1菌种斜面的保存5.2.1.1传代用菌种采用斜面冷藏保存。5.2.1.2将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，在适宜温度下培养至规定时间，生长充分后，转移至冰箱冷藏保存，以备实验传代用。此法用于实验用菌种的短期保存，随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常，灭菌处理后销毁。5.2.1.3保存时间与菌种类型有关，一般存储时间不超过9周，铜绿假单胞菌和分枝杆菌不超过6周，如保存期内，斜面出现缺水、干裂等情况，灭菌处理后销毁。5.2.2菌种冻存管的保存菌种可采用甘油、液体石蜡、瓷珠等方式冻存，根据其特性选择适宜冻存方法，常用方法参见附录B。冻存管注明菌种名称、菌种号、冻存日期等基本信息。菌种冻存管在-80℃保存不宜超过18个月。可间隔一段时间，将菌种冻存管复苏后，重新冻存。5.2.3真空冷冻干燥保存采用真空冷冻技术，将菌种冷冻干燥成菌粉后长期保存。菌种管注明菌种名称、菌种号、日期等基本信息，-20℃±2℃冷冻保藏。6菌悬液的制备6.1细菌繁殖体悬液的制备WS/T683—202046.1.1取第3代～第8代的营养琼脂培养基培养18h～24h的新鲜斜面培养物，用5.0mL吸管吸取3.0mL～5.0mL稀释液（除酸性电解水用生理盐水外，其他均用胰蛋白胨生理盐水溶液）加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。用5.0mL吸管将洗脱液移至另一无菌试管中，用电动混匀器混合20s，或在手掌上振打80次，使细菌悬浮均匀。6.1.2将制成的菌悬液，进行活菌培养计数，按其结果用稀释液稀释至所需浓度，悬液定量杀灭试验时，菌悬液浓度为1×108CFU/mL～5×108CFU/mL。6.1.3细菌繁殖体悬液冷藏保存备用，当天使用。6.1.4怀疑有污染时，以菌落形态、革兰染色与生化试验等方法进行鉴定。6.2枯草杆菌黑色变种芽胞悬液的制备6.2.1以无菌操作方式开启菌种管，加入适量营养肉汤培养基，吹吸数次，使菌种融化分散。取含5.0mL～10.0mL营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置36℃±1℃培养18h～24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，置36℃±1℃培养18h～24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养肉汤培养基，置36℃±1℃培养18h～24h，即为第3代培养物。6.2.2用10.0mL吸管吸取5.0mL～10.0mL第3代～5代的18h～24h营养肉汤培养物，接种于罗氏瓶（或细胞培养瓶）营养琼脂培养基表面，将其摇动使菌液布满培养基表面，将多余肉汤培养物吸出，罗氏瓶（或细胞培养瓶）置36℃±1℃恒温培养箱内培养5d～7d。6.2.3用接种环取少许菌苔涂于玻片上，以改良芽胞染色法染色。改良芽胞染色法：用接种环取菌苔涂于玻片上，自然干燥后，通过火焰加热将菌固定于玻片上；将涂片放入平皿内，片上放两层滤纸，滴加足量的5.0%孔雀绿水溶液，将平皿盖好，置55℃±1℃加热30min。取出，去滤纸，用自来水冲去残留液；加0.5%沙黄水溶液，1min后水洗，待干后镜检。芽胞呈绿色，菌体呈红色。在显微镜（油镜）下镜检，当芽胞形成率达90%以上时，即可进行以下处理。否则，继续在室温下放置一定时间，直至达到上述芽胞形成率后再进行以下处理。6.2.4加10.0mL无菌蒸馏水于罗氏瓶（或细胞培养瓶）中，以L棒轻轻刮下菌苔，吸出，再加入5.0mL无菌蒸馏水冲洗培养基表面，吸出。将两次吸出的菌悬液集中于含玻璃珠的无菌锥形烧瓶中，振摇5min。6.2.5将烧瓶置45℃水浴24h，使菌自溶断链，分散成单个芽胞。6.2.6用无菌棉花或纱布过滤芽胞悬液，清除琼脂凝块。6.2.7将芽胞悬液置无菌离心管内，以3000r/min速度离心30min。弃上清液，加蒸馏水吹吸使芽胞重新悬浮。再离心和重新悬浮清洗，本步骤重复进行3遍。6.2.8将洗净的芽胞悬液放入含适量小玻璃珠的烧瓶内，80℃水浴10min（或60℃水浴30min），以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后，摇匀分装后冷藏保存备用，有效使用期6个月。6.2.9芽胞悬液在使用时，先进行活菌培养计数。6.2.10怀疑有污染时，以菌落形态、革兰染色与生化试验等方法进行鉴定。6.3真菌悬液制备6.3.1白色念珠菌悬液的制备6.3.1.1取第3代～第6代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h～24h），用5.0mL吸管吸取3.0mL～5.0mL稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。用5.0mL吸管将洗脱液移至另一无菌试管中，用电动混匀器混合20s，或者在手掌上振打80次，使白色念珠菌悬浮均匀。WS/T683—202056.3.1.2将制成的菌悬液，进行活菌培养计数，按其结果用稀释液稀释至所需浓度，悬液定量杀灭试验时，菌悬液浓度为1×107CFU/mL～5×107CFU/mL。6.3.1.3菌悬液冷藏保存，当天使用。6.3.1.4怀疑有污染时，以菌落形态、革兰染色与生化试验等方法进行鉴定。6.3.2黑曲霉菌孢子悬液的制备6.3.2.1挑取第2代培养物中典型菌落，接种于麦芽浸膏营养肉汤培养基中，置30℃±1℃恒温培养箱中培养42h～48h，即为第3代培养物。6.