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书书书犐犆犛０７．０８０犃２１!#$%&’’()*犌犅／犜３８１７０—２０１９!#$%&’犃犵犪狉狅狊犲犫犪狊犲犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺犻犮犿犲犱犻狌犿２０１９１０１８()２０１９１０１８*+’(+,-./012!’’()*3/0456()书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由中国标准化研究院提出并归口。本标准起草单位：中国科学院过程工程研究所、中国标准化研究院、中科森辉微球技术（苏州）有限公司。本标准主要起草人：黄永东、赵岚、朱凯、吴学星、马光辉、苏志国、巩方玲、马爱进、杨维兴、王少云。Ⅰ犌犅／犜３８１７０—２０１９琼脂糖分离介质１ 范围本标准规定了琼脂糖分离介质的分类、技术要求、检测方法、检验规则、标签、标志、包装、运输和贮存。本标准适用于琼脂糖分离介质的生产与检测。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１９１ 包装储运图示标志ＧＢ／Ｔ５４７５ 离子交换树脂取样方法ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法３ 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１琼脂糖分离介质 犪犵犪狉狅狊犲犫犪狊犲犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺犻犮犿犲犱犻狌犿以琼脂糖为主要原料制备的一类球形分离介质。３．２非特异性吸附量 犪犿狅狌狀狋狅犳狀狅狀狊狆犲犮犻犳犻犮犪犱狊狅狉狆狋犻狅狀琼脂糖分离介质对细胞色素Ｃ的吸附量。４ 分类按琼脂糖含量分为４％琼脂糖分离介质和６％琼脂糖分离介质。５ 技术要求５．１ 外观要求琼脂糖分离介质应球形饱满、表面光滑，在光学显微镜下应具有透明性。５．２ 性能要求应符合表１中的规定。１犌犅／犜３８１７０—２０１９表１ 琼脂糖分离介质的主要性能要求项目指标４％琼脂糖分离介质６％琼脂糖分离介质粒径平均粒径（珚犱）／μｍ９０．０±１３．５３４．０±６．８９０．０±１３．５３４．０±６．８范围粒径比（犠粒径）／％≥９０ａ≥９０ｂ≥９０ａ≥９０ｂ最高流速ｃ／（ｃｍ／ｈ）≥２１０≥６０≥２７０≥６０固含量／％７．５０±１．６０１０．５０±２．００分配系数ｄ（犓ａｖ）０．５８～０．７０（犕ｐ＝２０００００）０．４３～０．６２（犕ｐ＝２０００００）０．６３～０．７５（犕ｐ＝１０００００）０．６８～０．８２（犕ｐ＝５００００）０．７７～０．８９（犕ｐ＝２００００）０．７２～０．８６（犕ｐ＝１００００）非特异性吸附量ｅ／（μｇ／ｍＬ）≤１８≤１８菌落总数／（ＣＦＵ／ｍＬ）＜１００＜１００５羟甲基糠醛脱落量／（μｇ／ｍＬ）ｐＨ３．０≤０．２５≤０．２５ｐＨ１３．０≤０．１５≤０．１５ 注：犕ｐ为探针分子相对分子质量。 ａ粒径在４５．０μｍ～１６５．０μｍ范围内试样颗粒的体积与全部试样颗粒体积之比。ｂ粒径在２４．０μｍ～４４．０μｍ范围内试样颗粒的体积与全部试样颗粒体积之比。ｃ在０．１ＭＰａ压力下可达最高流速。ｄ以葡聚糖为溶质。ｅ每毫升介质对细胞色素Ｃ的吸附量。６ 检测方法６．１ 外观６．１．１ 样品处理按照ＧＢ／Ｔ５４７５直接从产品中抽取５ｍＬ样品，置于５０ｍＬＧ３型号砂芯漏斗中抽干５ｍｉｎ。用符合ＧＢ／Ｔ６６８２的三级水清洗５次，每次２ｍｉｎ，最后用真空泵在０．１ＭＰａ压力下抽干５ｍｉｎ。将洗净的琼脂糖分离介质置于烧杯中，向其中补加三级水，保证琼脂糖分离介质上应有２ｃｍ的三级水。混匀后得到琼脂糖分离介质与水的混合体系。６．１．２ 样品观测用塑料吸管吸取混合体系置于载玻片上，调整显微镜放大倍数。以视野里８０％以上面积均为琼脂糖分离介质为标准，用塑料吸管增减载玻片上的琼脂糖分离介质，最后用盖玻片压上。调节光学显微镜焦距，使视野中的影像清晰。拍摄琼脂糖分离介质照片并保存。６．２ 粒径６．２．１ 样品处理方法同６．１．１。２犌犅／犜３８１７０—２０１９６．２．２ 样品检测设置激光粒度仪参数如下：测量颗粒类型为通用型，分散剂类型为水，分析模式为单峰模式，添加样品进行测定。６．２．３ 结果计算６．２．３．１ 范围粒径比按式（１）计算：犠粒径＝∑狀犽＝犻犠犽…………………………（１） 式中：犠粒径———范围粒径比，％；犠犽———粒径为犽（μｍ）颗粒的体积与全部试样颗粒体积之比，％；狀———试样颗粒粒径在４５．０μｍ～１６５．０μｍ范围内，狀＝１６５；试样颗粒粒径在２４．０μｍ～４４．０μｍ范围内，狀＝４４；犻———试样颗粒粒径在４５．０μｍ～１６５．０μｍ范围内，犻＝４５；试样颗粒粒径在２４．０μｍ～４４．０μｍ范围内，犻＝２４。６．２．３．２ 平均粒径平均粒径按式（２）计算：珚犱＝∑狀犽＝１犱犽犖…………………………（２） 式中：珚犱———所统计的一定数量介质颗粒的平均粒径，单位为微米（μｍ）；犱犽———单个颗粒的粒径，单位为微米（μｍ）；犖———所统计的介质颗粒的数目。在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１０％。６．３ 最高流速６．３．１ 样品处理方法同６．１．１。６．３．２ 样品装柱选用１．６０ｃｍ×２０．００ｃｍ的层析柱，堵住柱子出口，将介质与水的混合浆液倒入层析柱中，静置，控制介质床层高度为１０．００ｃｍ±０．２０ｃｍ，柱子上端充满水。打开柱子入口，以０．５ｍＬ／ｍｉｎ的流速连续向柱中通入１０个柱体积的三级水，床层稳定后即可进行测试。６．３．３ 样品测定将层析柱连入中低压层析系统。测定时，从零开始设定一定流速狏狓（ｍＬ／ｍｉｎ），保持该流速５ｍｉｎ后，记录此时柱压狆狓（ＭＰａ）。继续增加流速，并测定相应流速下的柱压。直到压力达到０．１０ＭＰａ为止，此时对应流速记录为狏０．１。３犌犅／犜３８１７０—２０１９６．３．４ 结果计算最高流速按式（３）计算：犉ｍａｘ＝６０狏０．１犛…………………………（３） 式中：犉ｍａｘ———最高流速，单位为厘米每小时（ｃｍ／ｈ）；狏０．１———在０．１０ＭＰａ压力下的体积流速，单位为毫升每分（ｍＬ／ｍｉｎ）；犛———层析柱截面积，单位为平方厘米（ｃｍ２）；６０———分钟转化为小时的换算系数。在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１０％。６．４ 固含量６．４．１ 样品处理方法同６．１．１。６．４．２ 样品称量将５ｍＬ琼脂糖分离介质与水的混合体系装入带１０μｍ孔径筛板的离心柱内，置于离心机，在２０００ｒ／ｍｉｎ下离心５ｍｉｎ。取出离心管，将样品小心倒入称量瓶内，盖严。在已恒重的两个称量瓶中分别称入１．０ｇ上述分离介质精确至０．１ｍｇ。６．４．３ 样品烘干称量将称量瓶开盖置于烘箱中，于１０５．０℃干燥至恒重。将称量瓶盖严，取出置于干燥器内，冷却３０ｍｉｎ至室温，称量。６．４．４ 结果计算固含量按式（４）计算：犠＝犿２－犿０犿１－犿０×１００…………………………（４） 式中：犠———固含量，％；犿１———干燥前称量瓶加试样质量，单位为克（ｇ）；犿２———干燥后称量瓶加试样质量，单位为克（ｇ）；犿０———称量瓶质量，单位为克（ｇ）。在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１０％。６．５ 分配系数犓犪狏６．５．１ 溶液配制６．５．１．１ １％（体积分数）丙酮溶液准确量取０．１ｍＬ丙酮，加水混合，定容至１０ｍＬ。６．５．１．２ ２犿犵／犿犔葡聚糖溶液准确称取２ｍｇ葡聚糖，加水混合，定容至１ｍＬ。４犌犅／犜３８１７０—２０１９６．５．１．３ 缓冲液，狆犎７．０准确称取１０．９３ｇ十二水合磷酸氢二钠、３．０４ｇ二水合磷酸二氢钠和８．７６ｇＮａＣｌ，加水溶解，调ｐＨ为７．０，最后定容至１０００ｍＬ。６．５．２ 样品处理方法同６．１．１。６．５．３ 样品装柱选用１．００ｃｍ×３０．００ｃｍ的层析柱，将介质与水的混合浆液倒入层析柱中，堵住柱子出口，静置，控制介质床层高度为３０．００ｃｍ±０．２０ｃｍ。打开柱子出入口，以一定流速连续向柱中通入１０个柱体积的三级水，床层稳定后即可进行测试。对于９０μｍ介质，流速为９．０ｍＬ／ｍｉｎ，对于３４μｍ介质，流速为６．０ｍＬ／ｍｉｎ。６．５．４ 样品测定用缓冲液以１．０ｍＬ／ｍｉｎ的流速平衡层析柱至示差检测器信号基线平衡。上样１％丙酮溶液测定丙酮的洗脱体积犞ｉ，上样相对分子质量犕ｐ＝２００００００葡聚糖测定洗脱体积犞ｏ。再将不同相对分子质量的葡聚糖单独上样：对于４％琼脂糖分离介质依次是葡聚糖犕ｐ＝２０００００，葡聚糖犕ｐ＝１０００００，葡聚糖犕ｐ＝２００００；对于６％琼脂糖分离介质依次是葡聚糖犕ｐ＝２０００００，葡聚糖犕ｐ＝５００００，葡聚糖犕ｐ＝１００００。所有葡聚糖样品浓度为２．０ｍｇ／ｍＬ。上样量均为２００μＬ。６．５．５ 结果计算分配系数犓ａｖ按式（５）计算：犓ａｖ＝犞ｅ－犞ｏ犞ｉ－犞ｏ…………………………（５） 式中：犞ｅ———各样品的洗脱体积，单位为毫升（ｍＬ）；犞ｉ———丙酮的洗脱体积，单位为毫升（ｍＬ）；犞ｏ———相对分子质量犕ｐ＝２００００００葡聚糖洗脱体积，单位为毫升（ｍＬ）。在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１０％。６．６ 非特异性吸附量６．６．１ 溶液配制６．６．１．１ 缓冲液犃，狆犎７．０准确称取４．３７ｇＮａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ和１．２２ｇＮａＨ２ＰＯ４·２Ｈ２Ｏ，加三级水溶解，调ｐＨ为７．０，最后定容至１０００ｍＬ，用０．４５μｍ过滤膜进行过滤。６．６．１．２ 缓冲液犅，狆犎７．０准确称取４．３７ｇＮａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ和１．２２ｇＮａＨ２ＰＯ４·２Ｈ２Ｏ和８．７６ｇＮａＣｌ，加三级水溶解，调ｐＨ为７．０，最后定容至１０００ｍＬ，用０．４５μｍ过滤膜进行过滤。６．６．１．３ ２．０犿犵／犿犔细胞色素犆溶液准确称取２００．０ｍｇ细胞色素Ｃ于１００ｍＬ容量瓶，用１０ｍＬ缓冲液Ａ溶解，定容，配成２．０ｍｇ／ｍＬ的５犌犅／犜３８１７０—２０１９标准储备液。上样前用０．４５μｍ过滤膜进行过滤。６．６．１．４ 细胞色素犆标准工作溶液分别取０．００ｍＬ、２．５０ｍＬ、５．００ｍＬ、１２．５０ｍＬ、２５．００ｍＬ、４０．００ｍＬ细胞色素Ｃ标准储备溶液至１００ｍＬ容量瓶中，用缓冲液Ａ溶液稀释至刻度，配成０．００ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１０ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．５０ｍｇ／ｍＬ、０．８０ｍｇ／ｍＬ标准工作溶液。６．６．２ 样品处理方法同６．１．１。６．６．３ 样品装柱选用１．６０ｃｍ×２０．００ｃｍ的层析柱，堵住柱子出口，将介质与水的混合浆液倒入层析柱中，静置，控制介质床层高度为５．００ｃｍ±０．２０ｃｍ。打开柱子入口，以１．０ｍＬ／ｍｉｎ的流速连续向柱中通入１０个柱体积的三级水，床层稳定后即可进行测试。６．６．４ 样品测定以缓冲液Ａ平衡，流速为２．０ｍＬ／ｍｉｎ，蛋白上样５ｍＬ。经缓冲液Ａ淋洗至淋洗液没有蛋白出现，再经缓冲液Ｂ洗脱，收集对应洗脱峰。记录洗脱峰体积犞Ｅ（ｍＬ）。用紫外分光光度计检测标准工作溶液和洗脱峰在２８０ｎｍ处的吸光度犃２８０，以标准工作溶液的吸光度与蛋白浓度做标准曲线，通过标准曲线定量洗脱峰蛋白浓度。６．６．５ 结果计算非特异性吸附量按式（６）计算：犠Ｎ＝犆Ｅ犞Ｅ犞ｇｅｌ×１０００…………………………（６） 式中：犠Ｎ———非特异性吸附量，单位为微克每毫升（μｇ／ｍＬ）；犆Ｅ———洗脱峰蛋白浓度，单位为毫克每毫升（ｍｇ／ｍＬ），由标准曲线计算出；犞Ｅ———洗脱峰体积，单位为毫升（ｍＬ）；犞ｇｅｌ———琼脂糖分离介质的体积，单位为毫升（ｍＬ）。在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１０％。６．７ 菌落总数６．７．１ 样品前处理方法同６．１．１。６．７．２ 样品测定参照《中华人民共和国药典》（２０１５年版）（１１０５）非无菌产品微生物限度检查———微生物计数法进行。取１ｍＬ抽干介质，加入１ｍＬ三级水，采用涡旋混合器混匀样品。将含有３０ｍＬ胰蛋白胨大豆琼脂培养基的锥形瓶１２