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进出口肉及肉制品中维吉尼霉素残留量检验方法杯碟法Methodforthedeterminationofvirginiamycinresiduesinmeatsandmeatproductsforimportandexport--CylindermethodSN／T1134—2002前言 本标准中的测定方法是采用日本厚生省1990年所编制的《畜、水产食品中的残留物质检验方法》中维吉尼霉素检验方法，其技术内容与原方法相同，具体操作方法稍加改动，经试验和验证后，按规定要求作了编辑性修改。本标准中同时制定了抽样和制样方法。 测定低限是根据国际上对肉品中维吉尼霉素残留量和测定方法灵敏度而制定的。 本标准的附录A是规范性附录，附录B是资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：王素琴、何霖、孙俐、陈子红。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1范围 本标准规定了进出口肉及肉制品中维吉尼霉素残留量检验的抽样、制样和杯碟测定方法。 本标准适用于进出口冻鸡肉中维吉尼霉素残留量的检验。2抽样和制样2.1检验批 以不超过2500件为一检验批。 同一检验批的商品应具相同的特征，如包装、标记、产地、规格和等级等。2.2抽样数量 批量／件 最低抽样数／件 1～25 1 26～100 5 101～250 10 251～500 15 501～1000 17 1001～2500 202.3抽样方法 按2.2规定的抽样件数随机抽取，逐渐开启。 每件至少一袋为原始样品。如每件中无小包装或有小包装，但每袋重量超过2kg，则可用灭菌刀从每件中割取不少于100g样品，混合后置于清洁容器内作为混合样品。原始样的总量不少2kg，加封后标明标记，及时送交实验室。2.4试样制备 从原始样品中取出部分有代表性的样品，将可食部分用绞碎机绞碎，充分混匀，用四分法缩分至不少于500g，作为试样，装入清洁容器内，密封后，标明标记。2.5试样保存 将试样于一18℃以下冷冻保存。 注：在抽样和制样的操作过程中，必须防止样品受到污染后发生残留物含量的变化。3测定方法3.1方法提要 用乙醇提取试样中残留的维吉尼霉素，经均质、离心后取上清液作为样液，取上清液与结膜干燥棒杆菌作用，根据产生抑菌圈直径大小，并查阅标准曲线，计算出样品中维吉尼霉素的残留量。3.2试剂和材料 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。本方法标准品及其标准溶液均以效价计。3.2.1无水乙醇。3.2.2无水甲醇。3.2.3甲醇+水(1+2)。3.2.4生理盐水：称取8.5g氯化钠，溶于1000mL水中，121℃灭菌15min。3.2.5磷酸二氢钾。3.2.6磷酸氢二钠。3.2.7磷酸盐缓冲液(pH6.O)：称取3.5g磷酸二氢钾(精确至0.1g)溶于400mL水中，另外称取3.0g磷酸氢二钠(精确至0.1g)，溶于400mL水中，将两种溶液混合在一起定容至1000mL。3.2.8维吉尼霉素标准品。3.2.9维吉尼霉素标准贮备液：准确称取适量的维吉尼霉素标准品，用甲醇溶液(3.2.3)溶解后定容至50mL，配成1000μg／mL的维吉尼霉素标准贮备液，于4℃保存，一周内使用。3.2.10维吉尼霉素标准工作液：吸取一定量的标准贮备液，用磷酸盐缓冲液分别稀释成浓度为O.025μg／mL、0.05μg／mL、0.1μg／mL、0.2μg／mL、0.4μg／mL和0.8μg／mL标准工作溶液，以上稀释均须当日配制。3.2.11实验菌种：结膜干燥棒杆菌(Corynebacteriumxerosis)。3.2.12培养基I(见附录A1)。3.2.13培养基Ⅱ(见附录A2)。3.2.14培养基Ⅲ(见附录A3)。3.3仪器和设备3.3.1游标卡尺：测量范围0mm～200mm，精度0.02mm，或抑菌圈测量仪。3.3.2牛津杯：高10mm±0.1mm，内径6.Omm±0.1mm，外径8.Omm±0.1mm。3.3.3离心机：不低于3000r／min。3.3.4恒温培养箱：30℃±1℃，36℃±1℃，50℃±1℃，隔板保持水平。3.3.5高压灭菌器。3.3.6绞碎机：不低于3000r／min。3.3.7均质器：不低于10000r／min，带均质杯250mL。3.3.8培养皿：内径90mm，底部平整光滑的玻璃皿或塑料皿，并应配有陶瓦盖。3.3.9其他：玻璃板、吸管、毛细管等。3.4测定步骤3.4.1试液制备 准确称取10g试样(精确至0.1g)于均质杯中，加入10mL乙醇，均质2min后移人离心管中，以3000r／min离心20min，取其上清液，作为试液。3.4.2菌液的制备 将实验菌种(3.2.11)安瓿瓶的上部消毒后敲碎，加入少量培养基Ⅱ于试验菌种中，使其充分溶解并移至盛有培养基Ⅱ的试管中混均，置37℃±1℃培养24h，将培养物划线接种到培养基I斜面上。 用适量灭菌生理盐水冲洗菌苔并转入灭菌试管中，4℃保存，可使用一周。3.4.3测定3.4.3.1平板制备 将培养基Ⅲ熔化并冷却至50℃±1℃，加入适量的菌液，使之充分混合后，取8mL注入灭菌平皿中，保持水平，待其凝固后备用。 测定前，须先用0.05μg／mL及0.2μg／mL的维吉尼霉素标准工作液进行预测试，经培养后，O.05μg／mL标准工作液所呈现的抑菌圈直径在10mm～15Trim，而0.2vg／mL标准工作液所呈现的抑菌圈直径在15mm～20mm，该菌液浓度为最佳。3.4.3.2标准曲线的绘制 用0.025μg／mL、0.05μg／mL、0.1μg／mL、0.2μg／mL、0.4μg／mL和0.8μg／mL共六个浓度的维吉尼霉素标准工作液，其中用于最低浓度(0.025μg／mL)的三个检定平板作为产生阴性结果的对照，并以O.2μg／mL作为参考浓度。标准曲线上的每个标准浓度取三个检定用平板为一组。在每个检定用平板上放置六个牛津杯，其中三个加满参考浓度溶液，另三个加满标准浓度溶液，参考浓度与标准浓度溶液要间隔放置，五个标准浓度共用15个检定用平板，含量最低的标准浓度的三个检定用平板作为阴性结果的平板对照，其他12个检定用平板绘制标准曲线。 将陶瓦盖盖好，4℃放置1h～2h后于30℃土1℃培养17h±1h，最后在36℃±1℃培养6h，然后翻转平板，除去牛津杯，精确测量产生的抑菌圈直径(精确到0.1mm)，用所有45个参考浓度抑菌圈直径的平均值与各平板参考浓度抑菌圈直径平均值的差值作为每个平板的校正值，来校正其他各标准浓度的抑菌圈直径的平均值。 将校正后的值，用式(1)、式(2)算出L和H，在半对数坐标纸上以抑茵圈直径(mm)为横坐标(算术级)，以浓度μg／mL为纵坐标(对数级)绘制标准曲线。…………………………………(1)…………………………………(2)式中： L——标准曲线上的最低浓度(0.05μg／mL)抑菌圈直径，单位为毫米(ram)； H——标准曲线上的最高浓度(0.8μg／mL)抑菌圈直径，单位为毫米(ram)； c——标准曲线中全部参考浓度抑菌圈直径的平均值，单位为毫米(mm)； a、b、d、e——分别表示标准曲线中其他浓度标准工作液(0.05μg／mL、0.1μg／mL、0.4μg／mL、 O.8μg／mL)的抑菌圈直径经校正的平均值，单位为毫米(ram)。3.4.3.3样液的测定 每个样液用三个检定平板，每个平板平均置六只消毒的牛津杯，间隔注满样液和0.2μg／mL维吉尼霉素标准工作液，4℃放置1h～2h后，于30℃±1℃培养17h±1h，最后在36℃±1℃下培养6h。3.5结果的计算和表述 培养后，测量抑菌圈直径，如样液抑菌圈直径小于12mm，即报告为“阴性”；如大于等于12mm，分别求出三个平板中0.2μg／mL标准液及样液产生的抑菌圈直径平均值，经校正并查标准曲线，再用式(3)计算试样中维吉尼霉素的含量。………………………………………(3)式中： X——试样中维吉尼霉素的含量，单位为毫克每千克(mg／kg)； c——从标准曲线上查出样液所对应的抗生素浓度，单位为微克每毫升(vg／mL)； m——最终试液所代表的样品浓度，单位为克每毫升(g／mL)。 注：如测定结果呈阳性，即抑菌圈直径平均值大于等于12mm时，需进行确证试验(参见附录B)，以证明抑菌物确系维吉尼霉素。4测定低限、回收率4.1测定低限 本方法的测定低限为0.05mg／kg。4.2回收率 鸡肉中维吉尼霉素添加浓度及其回收率的实验数据： 0.05mg／kg时，回收率为80.0%； 0.1mg／kg时，回收率为81.0％； 0.2mg／kg时，回收率为81.3％。附 录A(规范性附录)培养基成分及制备方法A1培养基I 蛋白胨 10．0g 牛肉膏 5．0g 氯化钠 2．5g 琼脂 12．0g 水 1000mL 将上述各成分于水中加热溶解，用1mol／L氢氧化钠溶液或10％盐酸调节pH，使其灭菌后pH值为6.5±0.1，分装于试管或克氏瓶内，于121℃高压灭菌15min，制成斜面备用。A2培养基Ⅱ 蛋白胨 10.0g 牛肉膏 5.0g 氯化钠 2.5g 水 1000mL 将上述各成分溶于水中加热溶解，用1mol／L氢氧化钠溶液或10％盐酸调节pH，使其灭菌后pH值为7.0±0.1，分装于试管内，121℃高压灭菌15min。A3培养基Ⅲ 蛋白胨 10.0g 牛肉膏 3.0g 氯化钠 5.0g 琼脂 12.0g 水 1000mL 将上述各成分子水中加热溶解，用1mol／L，氢氧化钠溶液或10％盐酸调节pH，使其灭菌后pH值为6.7±0.1，分装于三角瓶内，121℃高压灭菌15min。附 录B(资料性附录)确证试验 确证试验采用生物自显影法，用标准品作对照，求Rf值。 微量注射器：50μL。 薄层板：硅胶，Q／YT257—85SG，5cm×20cm，使用前110℃活化2h。 展开剂：三氯甲烷+甲醇+乙酸(86+12+2)。 展开槽：240cm×57cm×32cm。 点样量：20μL。 长方形培养皿：20cm×10cm×5cm。 展开：在饱和槽内进行。 检测：取经活化的薄层板，在其下端2cm处划一条基线，然后在该线上分别取20μL试液和0.20μg／mL浓度的维吉尼霉素标准溶液，两点相距2.5mm，置展开槽中，用展开剂进行展开，直至溶剂前沿线距板顶端1.5cm处为止。取出薄层板，待风干后放入经高压消毒的长方形培养皿中，将已熔化并冷却至50℃±1℃的培养基Ⅲ均匀地喷在表面，然后用10mL上述已适量接种菌悬液的培养基，铺满整个薄层板，待其凝固，4℃放置1h～2h后于30℃土1℃培养17h±1h，最后在36℃±1℃下培养6h。 经培养后，在薄层上与维吉尼霉素标准液产生抑菌圈的Rf值相同位置上，显现抑菌圈者即为阳性。