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ICS65.020.20CCSB16中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2757—2022代替SN/T2757—2011植物线虫检测规范Rulesfordetectionofplantparasiticnematodes2022-07-07发布2023-02-01实施中华人民共和国海关总署发布学兔兔—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件代替SN/T2757—2011《植物线虫检测规范》,与SN/T2757—2011相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下:———增加了术语和定义、现场取样章节;———对第7章进行了丰富,增加了各环节的要点和注意事项;———删除了原文件附录A中的线虫分离方法、附录C中的常用培养方法和附录D中的线虫常用溶液;———在附录A中增补了Deman公式、线虫学描述常用语和通用线虫分子鉴定方法。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中国海关科学技术研究中心、中华人民共和国宁波海关、中华人民共和国天津海关、中华人民共和国广州海关、中华人民共和国昆明海关、中华人民共和国北京海关、中华人民共和国青岛海关、中华人民共和国黄埔海关。本文件主要起草人:边勇、顾建锋、王金成、赵立荣、杜宇、刘若思、刘乐乐、皋司虎、封立平、曹志玲。本文件于2011年发布为SN/T2757—2011,本次为第一次修订。ⅠSN/T2757—2022学兔兔范围本文件规定了进出境植物线虫的检测规范。本文件适用于进出境植物及植物产品、媒介昆虫、土壤及栽培介质中线虫的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27402实验室质量控制规范植物检疫SN/T1848植物有害生物鉴定规范SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样SN/T1724进境针叶树原木、木制品和木质包装材料中松材线虫的检疫操作规程SN/T4643线虫标本采集分离保存规范3术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3.1DeMan公式DeMan’sformulaDeMan(1880)提出的一套用系列字母代表的线虫形态测量值或测量比值,适用于线虫形态的描述。3.2植物线虫plantnematode能够侵染植物,引起植物病害,造成产量损失或植物产品质量变劣的线虫类群。注:通常被称为植物寄生线虫或植物病原线虫,简称植物线虫。3.3媒介昆虫vectorinsect所有能够携带、传播植物病原线虫的昆虫。注:常见的线虫媒介昆虫有吉丁虫科Buprestidae,象甲科Curculionidae,小蠹科Scolytidae和天牛科Cerambycidae等。4原理植物线虫可随植物及植物产品、媒介昆虫、土壤及栽培介质等作远距离传播。线虫检测工作的一般原理是利用线虫的自主活动性、趋水性、密度、体型大小等特点,使用直接解剖法、改良漏斗法、密度离心1SN/T2757—2022学兔兔标准下载法、漂浮法等将其从寄主植物、土壤或栽培介质、包装材料等中分离出来,然后以形态学方法为主,辅以DeMan测计值,结合分子生物学、生态学、生物学、生物化学、细胞学等方法,综合判定其分类地位———科、属、种及亚分类单元的一项工作。5仪器设备、器具和主要试剂5.1仪器设备体视显微镜(具透射光源和落射光源)、生物显微镜、冷藏冰箱、超低温冰箱、离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、高压灭菌锅、烘箱、加热板、水浴锅、离心机等。5.2器具自封袋、表面皿或培养皿、载玻片、盖玻片、凹玻片、网筛(10目、20目、50目、80目、120目、360目、500目)、烧杯、漏斗、漏斗架、浅盘、乳胶管或硅胶管、止水夹、小镊子、斧头、剪刀、医用解剖刀、线虫滤纸或面巾纸、酒精灯、干燥器、试管、线虫挑针、记号笔、毛刷、毛笔、玻璃纤维丝、PCR管、可调式微量移液器(2μL~1000μL)及相应的吸头等。5.3主要试剂实验用试剂一般应为分析纯,实验用水应符合GB/T6682相关规定。主要试剂包括:福尔马林(4%甲醛)、指甲油、阿拉伯树胶、凡士林、纯甘油、无水乙醇、石蜡、蔗糖、核酸胶染料(GelRed)、PCR反应所需引物、2×TaqMasterMix预混液、蛋白酶K(20mg/mL)、TaqDNA聚合酶、DL2000Marker、冰乙酸(C2H4O2)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA•2H2O)、无RNase无菌水和灭菌双蒸水等。6现场检疫与取样6.1现场检疫按照SN/T2122的方法进行现场检疫和抽样。重点检查是否有线虫危害症状,应注意线虫为害早期通常无明显症状,侵染后期症状逐步出现,具体症状与植物种类、可能携带线虫种类、侵害程度、为害部位等有关,除6.2所述常见症状外,还可针对不同种类,参考相关文献资料予以掌握。6.2症状检查6.2.1植物的检查地上部分有无生长不良,植株矮化、叶色失绿、黄化、坏死、萎蔫,叶、茎或其他组织是否坏死、肿大、畸形等;植物材料横切面有无腐烂、变色。茎、叶、花、芽、果实等线虫可能寄生的部位均应仔细检查,看是否有线虫为害症状。地下部分有无根系腐烂变黑,须根是否增生,根部有无斑点、斑痕等。根部特别要注意根茎、块茎、球茎等部位有无根结、瘿瘤,有无黄色、褐色或白色针头大小的颗粒状物,茎杆中部是否有孔形、环形、点状腐烂,块根、块茎是否干缩龟裂和腐烂等。6.2.2种子的检查肉眼和手持放大镜仔细检查种子,拣出畸形、变色、虫瘿、干秕种子等有为害症状的可疑种子,并收集其中夹带的介质或土壤等杂质,分别用塑料袋装好,加贴标识,带回实验室检测。2SN/T2757—2022学兔兔其他材料的检查植物、植物材料和植物产品等是否夹带土壤或其他栽培介质等;木质部是否有蓝变,有无媒介昆虫栖居的痕迹,如侵入孔、蛀道、蛹室等;纵切植株组织是否有虫蛀隧道及媒介昆虫幼虫与成虫等。如有,收集相关样品,带回实验室检测。6.3取样检查时发现明显症状的情况下,应有针对性地抽取具有可疑症状的样品及邻近样品;对于无可疑症状的样品则按要求随机抽样;对于根部包裹有栽培介质的植物,应以主根为中心进行取样。采集的样品分别用塑料袋装好,加贴标识,并尽快送实验室检测。7实验室检测7.1样品接收样品传递过程中应避免在高温环境下时间过久。实验室收到样品后,如不能立即对样品实施检测,应将样品置于4℃~10℃冷藏冰箱进行短期保存,注意保湿、透气、避光,并尽快实施检测。7.2样品的前处理7.2.1植物组织将植物材料(根、茎、叶、果实及种子)切成小段或薄片(厚度0.5cm),或将种子等较小的植物材料撕开,待测。在进行植物组织样品前处理过程中,可同时对切开的植物组织进行症状检查,察看是否存在线虫侵害状,如组织穿孔、腐烂等。7.2.2土壤及栽培介质将从植物材料和运输工具上收集到的土壤或介质混匀,取100mL以上作为待测样品。不足100mL则全部检测。7.2.3媒介昆虫将媒介昆虫或部分虫体放入小钵里研碎,加水浸泡数小时后直接镜检。7.2.4原木、木制品和木质包装材料将原木、木制品和木质包装材料劈成薄片(厚度0.5cm)作为待测样品。具体可参照SN/T1724。7.3线虫分离线虫分离是线虫检测的关键步骤之一。首先应考虑如何更有效地获得目标线虫,根据线虫的寄生部位、体型大小等因素不同,在进行线虫分离时,应选择一种或多种方法进行线虫分离。如改良漏斗法仅适用于分离蠕虫形线虫,而线虫孢囊的分离则应使用直接解剖法、过筛法或漂浮法。在具体操作时,也需根据重点对象,对分离条件进行适当调整,如分离一些体型较大的蠕形线虫时,采用漏斗法时在确保分离液不会被土壤、植物颗粒等沉淀物严重污浊前提下,应使用孔径较大的筛网、面巾纸或纱布等作为载体,同时适当增加分离时间(如从24h增加到48h,但应注意过长的分离时间有可能导致线虫死亡以及其他微生物大量滋生等影响观察效果,因此一般分离时间不超过72h),也可采用密度离心法等适宜方法。3SN/T2757—2022学兔兔标准下载在针对特定种类进行检测时,还可根据该类线虫的主要寄生部位,对样品不同部位分别进行线虫分离,如检测一些叶芽寄生线虫时,将植物叶芽与植物根茎分别进行分离检测,可减少混合分离时根部腐生线虫对鉴定工作的干扰,提高工作效率。常用的线虫分离方法可参见SN/T4643。7.4体视显微镜观察分离获得的线虫悬浮液中通常包含多种线虫,其中尤以腐生线虫为多。为提高工作效率,一般应首先使用体视显微镜,在适当倍数下,进行线虫初筛。具备一定经验的检测人员,可通过体视显微镜对植物线虫和腐生线虫等进行准确区分,或对植物线虫的检疫意义进行初步判断,发现具有检疫意义的植物线虫时,再挑取线虫制成临时玻片或永久玻片后,再使用生物显微镜进行形态观察或鉴定。7.5线虫标本制作线虫标本制作方法参见附录B。7.6生物显微镜观察和测量在生物显微镜下观察线虫的形态结构,进行特征观察,使用线虫分类检索表或相关线虫鉴定资料进行特征比对,对主要鉴定特征进行重点观察、拍摄和测计,进而进行形态学判定。对线虫进行测计,通常采用DeMan公式,同一性别、同一龄期的线虫个体需测量20条以上,不足20条的应全部测量。7.7二次取样或线虫培养当发现疑似检疫性线虫种类,且分离到的线虫数量较少或为幼虫时,可根据实际情况,进行二次取样再分离。对于有培养方法的种类,可进行培养或孵育后再进行形态鉴定。注:多数情况下线虫培养时间较长,对环境条件等有较高要求,且易被螨虫、霉菌等污染,导致培养失败,宜同时采取分子生物学等方法进行鉴定。8线虫的形态学鉴定8.1工作要点线虫的形态学鉴定主要是通过对虫体的外部特征(如体形、体表、头部和尾部特征)、内部特征(如消化系统、生殖系统等)的观测而判断其分类地位的过程,通常雌虫具有更丰富的鉴定特征,是进行种类判断的主要依据,而一些种类也会利用雄虫和幼虫的一些特征作为依据。在进行植物线虫检测鉴定时,应优先进行形态学鉴定,至少将线虫鉴定到属的水平,才能对其是否具有潜在检疫意义作出初步判断。形态学鉴定的前提是熟知线虫形态学术语,掌握各术语所指特征的具体位置。受标本制作效果、线虫发育程度、观察体位、观测焦距等诸多因素影响,一些特征在观察时难以准确观测,甚至无法看到,需要针对多个个体进行观察,反复比较,并进行综合判断。除观察结构特征外,对线虫体长、体宽、虫体各个体段的长度、比例以及一些特征结构的长宽等体型特征的测计,也是线虫鉴定的参考依据。对线虫进行测计时,应首先掌握各值测量的方式,如虫体全长应从口孔到尾端计算(虫体弯曲时应沿虫体中线测量曲线);体宽指体中部宽度(最大体宽一般则在雌虫的阴门或雄虫的输精管附近);尾长是从肛门的体中部测量到尾最末端等。8.2线虫属的鉴定线虫属一级的鉴定一般依靠形态学方法即可完成。鉴定工作中,使用某一分类系统,通过二项检索确定所在属后,再对其属内特征进行观察确认,主要特征符合描述时即可判定,通常观察利用到的特征4SN/T2757—2022学兔兔标准下载包括。———体型:长短、形状、最大体宽、雌虫是否膨大、雌雄异型等。———角质膜:厚度、体表环纹的结构及宽度、侧带和侧线数量、侧尾腺口位置等。———头部:突出程度、形状、环纹数;有无头冒、有无乳突或刚毛;头部骨架发育程度;侧器位置及形状等。———口腔:形状及大小、唇片的形状、唇环数量等。———口针:形状、长短、内空针或齿针,基部球形状、口针基杆长度、口针锥部长度等。———食道:背食道腺开口的位置;食道体部的形状、长度和厚度;中