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ICS67.180.10CCSX31中华人民共和国供销合作行业标准GH/T1356—2021GH枇杷蜜植物源成分的检测实时荧光PCR法IdentificationofLoquatSpeciesinLoquatHoney—Real-timePCRMethod2021-11-08发布2022-01-01实施中华全国供销合作总社发布GH/T1356—2021I前言本文件按照GB/T1.1《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华全国供销合作总社提出。本文件由全国蜂产品标准化工作组（SAC/SWG2）归口。本文件起草单位：中国计量大学、中国农业科学院蜜蜂研究所、安徽中杰检测技术有限公司、中国蜂产品协会、金华市农业科学研究院、杭州余杭归蜜家庭农场、蜜中情（杭州）蜂业科技有限公司。本文件主要起草人：李红亮、王秀红、谭丽蕊、苏晓玲、吴帆、杨雪梅、张籍、季连光、于浩。GH/T1356—20211枇杷蜜植物源成分的检测实时荧光PCR法1范围本文件规定了枇杷蜜中植物源成分的实时荧光PCR检测方法。本文件适用于以枇杷作为蜜源的蜂蜜中特有枇杷植物源成分的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1枇杷Loquattree枇杷（RhaphiolepisbibasL.）（原EriobotryajaponicaL.），蔷薇科、石斑木属（原枇杷属）植物。3.2枇杷蜜Loquathoney蜜蜂采集枇杷的花蜜，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质。3.3实时荧光PCRreal-timePCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程，实现对起始模板的定量及定性分析。3.4循环阈值Cyclethreshold每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。4缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid)GH/T1356—20212PCR：聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction)qPCR：定量聚合酶链式反应(Quantitativepolymerasechainreaction)CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethylammoniumbromide)OD260/280：260nm/280nm下的光密度值(OpticalDensity)Ct值：循环阈值(Cyclethreshold)FAM：羧基荧光素(Carboxyfluorescein)TAMRA：羧基四甲基罗丹明(Carboxy-tetramethyl-rhodamine)5原理从枇杷蜜中分离枇杷植物源成分并提取其DNA，进行实时荧光qPCR反应。通过荧光信号是否对数增长而判断扩增是否成功，再通过扩增获得的Ct值大小，判定是否含有枇杷植物源成分。6仪器设备6.1实时荧光PCR扩增仪6.2高速冷冻离心机6.3超微量紫外可见分光光度计6.4恒温水浴锅6.5分析天平：感量0.1mg。6.6微量移液器：量程0.1µL－2.5µL,0.5µL－10µL，2µL－20µL，20µL－200µL,200µL－1000µL。7试剂和材料7.1引物7.1.1上游引物F：5’-GCCCGGCGTCCCCTTATC-3’7.1.2下游引物R：5’-ATCGCATTTCGCTACGTTCTTCAT-3’7.1.3荧光探针P：FAM-5’-CGTATTGCGCCAAGGAACTCGAACGAAAGAG-3’-TAMRA7.2对照样品7.2.1阴性对照：非枇杷植物DNA（如油菜、党参、茶等）。7.2.2阳性对照：枇杷叶。7.2.3空白对照：实时qPCR反应时以水代替扩增DNA模板。7.3试剂除非另有规定，本文件中所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T6682一级水的规定。7.3.1适合荧光探针法的qPCR反应试剂(2×)，GH/T1356—202137.3.2实时荧光qPCR专用参比染料(50×)7.3.3CTAB裂解缓冲液（配制方法见附录A.1）7.3.4提取缓冲液（配制方法见附录A.2）7.3.5亚硫酸氢钠（Sodiumdisulphite）7.3.6聚乙烯吡咯烷酮-40（PVP-40）7.3.75%十二烷基肌氨酸钠（配制方法见附录A.3）7.3.8氯仿/异戊醇（体积比24:1）7.3.9异丙醇（-20℃预冷）7.3.1070%乙醇8操作程序8.1提取工作液各取41.7mLCTAB裂解缓冲液(7.3.3)和提取缓冲液(7.3.4)，再依次加入0.5g亚硫酸氢钠(7.3.5)和2g聚乙烯吡咯烷酮-40(7.3.6)，充分振荡混匀，加入5%十二烷基肌氨酸钠（约16mL）(7.3.7)，制成100mL提取工作液。工作液需现用现配。8.2样品处理和DNA提取8.2.1称取25g蜂蜜样品，与30mL无菌水混合，振荡混匀。8000r/min离心25min。8.2.2弃上清液,将沉淀溶解于1mL现配的提取工作液(8.1)中。充分混匀后，于37℃水浴过夜。8.2.3次日，向样品中加入等体积氯仿/异戊醇（体积比24∶1）(7.3.8)，缓慢颠倒混匀30min，4000r/min离心20min。8.2.4转移上清至新离心管中，加入等体积4℃预冷的异丙醇(7.3.9)。4000r/min离心30min。8.2.5弃上清，DNA位于沉淀中，样品中加入70%乙醇(7.3.10)溶液反复吹打洗涤。8.2.6离心后弃去乙醇，室温或37℃烘干至乙醇完全挥发，加25μLH2O溶解DNA，于–20°C保存。8.3提取DNA的浓度和OD260/280测定吸取1μL提取的DNA样品(8.2.6)，利用超微量紫外可见分光光度计测定提取DNA样品的浓度(单位为ng/µL)和OD260/280数值(理想值应为1.8左右)，DNA稀释到10ng/μL备用。8.4实时荧光PCR反应8.4.1实时荧光PCR反应体系实时荧光PCR反应体系按表1规定配制，每个样品和参照重复扩增2次，Ct值取平均值。配制反应液时尽量避光且避免产生气泡。GH/T1356—20214表1实时荧光PCR反应体系配制表体系组分用量终浓度实时荧光PCR反应液适合荧光探针法的qPCR反应试剂(2×)10.0μLddH2O6.0μL上游引物F(10μM)0.4μL0.2μmol/L下游引物R(10μM)0.4μL0.2μmol/L荧光探针P(10μM)0.8μL0.4μmol/LROXReferenceDye(50×)0.4μL样品DNA(100.0ng/μL)2.0μL10.0ng/μL总量20μL8.4.2实时荧光PCR反应参数和条件95℃预变性20s，然后95℃3s、60℃30s，45个循环。反应参数和条件仅供参考，具体可根据所用探针法qPCR试剂和实时荧光PCR仪操作说明书设置。9质量控制以下条件有一条不满足时，实验视为无效：a)阳性对照：应有荧光对数增长，并出现典型的扩增曲线，Ct值≤30。b)阴性对照：应无荧光对数增长或典型的扩增曲线，或相应的Ct值＞40。c)空白对照：应无荧光对数增长或典型的扩增曲线，或相应的Ct值＞40。10结果判断与表述10.1结果判定在符合第9步的情况下，结果判定如下：a)Ct值≤37，则判定为阳性。b)Ct值≥40或无荧光对数增长或典型扩增曲线，则判定为阴性。c)37＜Ct值＜40，则重复实验一次。再次扩增后Ct值＜40，则判定为阳性；Ct值≥40，则判定为阴性。10.2结果表述10.2.1DNA提取(8.3)浓度＜5.0ng/μL，表述为“未提取到有效的植物DNA组分”。10.2.2目标成分阳性，表述为“检出枇杷成分”。10.2.3目标成分阴性，表述为“未检出枇杷成分”。11检测过程中防止交叉污染的措施GH/T1356—20215检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中附录D的规定执行。GH/T1356—20216AA附录A（资料性）溶液的配制A.1CTAB裂解缓冲液裂解缓冲液（2％CTAB，0.2mol/LTris•HClpH8.0，0.05mol/LEDTApH8.0，2mol/LNaCl）CTAB4gTris4.8gEDTA2.9gNaCl23.3gH2O溶解，用浓盐酸与NaOH将溶液pH调至8.0，并定容至200mL，高压灭菌后4℃保存。A.2提取缓冲液提取缓冲液（0.35mol/L山梨醇，0.1mol/LTris•HClpH8.0，0.05mol/LEDTApH8.0）山梨醇（Sorbitol）12.75gTris2.4gEDTA0.29gH2O溶解，用浓盐酸与NaOH将溶液pH调至8.0，并定容至200mL，高压灭菌后4℃保存。A.35%十二烷基肌氨酸钠十二烷基肌氨酸钠（Sarcosylstock）5gH2O溶解，定容至100mL，高压灭菌后4℃保存。GH/T1356—20217BB附录B（资料性）枇杷成分的基因扩增靶标参考序列（GenBankID:kj170769）GCCCGGCGTCCCCTTATCCCGGAAGCCTGCTTCCGGGCGTACAAACGAACACCGGCGCGTATTGCGCCAAGGAACTCGAACGAAAGAGCGAGCTCCCGTCGCCCCGGAAACGGTGCGCGCGCGGGTGCGTCGTCGTCTTCAGTACGTCAAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGAT。