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ICS13.060CCSC51WS中华人民共和国卫生行业标准WS/T799—2022污水中新型冠状病毒富集浓缩和核酸检测方法标准MethodforenrichmentandnucleicaciddetectionofSARS-CoV-2insewage2022-03-24发布2022-03-24实施中华人民共和国国家卫生健康委员会发布WS/T799—2022I前言本标准由国家卫生健康委环境健康标准专业委员会负责技术审查和技术咨询，由中国疾病预防控制中心卫生标准处负责协调性和格式审查，由国家卫生健康委员会疾控局负责业务管理、法规司负责统筹管理。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、清华大学、中国科学院生态环境研究中心、中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所。本标准主要起草人：张岚、唐宋、黄霞、杨敏、张晓、张良、王园媛、刘艳臣、田哲、段招军。WS/T799—20221污水中新型冠状病毒富集浓缩和核酸检测方法标准1范围本标准规定了污水中新型冠状病毒富集浓缩和核酸检测方法。本标准适用于生活污水、医疗机构污水中新型冠状病毒富集浓缩和核酸检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法WS/T697新冠肺炎疫情期间特定人群个人防护指南3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。新型冠状病毒severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2，SARS-CoV-2属于β属冠状病毒，基因组为线性单股正链的RNA病毒，全长约30kb，有包膜，呈圆形或椭圆形颗粒状，直径为60nm～140nm。Ct值cyclethreshold在实时荧光定量PCR中，每个反应体系中的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。实时荧光反转录聚合酶链式反应real-timefluorescentreversetranscriptionpolymerasechainreaction在反转录DNA聚合酶链式反应的扩增反应中加入荧光化学物质，通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测实现对起始模板定量及定性的分析方法。4检出限富集浓缩采用聚乙二醇沉淀法或铝盐混凝沉淀法时，方法检出限为10copies/mL；富集浓缩采用离心超滤法时，方法检出限为100copies/mL。5水样的采集、运输及保存根据采样场所排水系统分布情况，重点选取污水排水口、内部管网汇集处等关键位置对未经消杀处理的污水进行采样。用无菌聚乙烯瓶采集污水样本，采样体积为300mL。可根据现场条件和检测需求确定水样采集方式，如瞬时水样（采样点位某一时间随机采集的样本）或混合水样（同一采样点位不同时间所采集的瞬时水样混合后的样本）。样本采集后应在现场使用75%酒精对采样瓶外表面进行消毒，然后将采样瓶装入密封采样袋中，对密封采样袋外表面再次进行消毒，并尽快将样本送至实验室，运输过程中确保0℃～4℃条件下冷藏运输。到达实验室后样本同样应保存于0℃～4℃环境中，实验室应在接到样本后24h内进行富集浓缩处理，并在富集浓缩后24h内完成核酸提取及实时荧光反转录聚合酶链式反应（实时荧光RT-PCR）检测。6病毒灭活WS/T799—20222将样本充分混匀后置于60℃水浴30min。注：水浴锅水位应高于样本液面，确保容器内样本达到目标温度。7病毒富集浓缩注：本部分中三种新型冠状病毒富集浓缩方法适用条件相同，使用过程中可根据实验条件进行选择。聚乙二醇沉淀法7.1.1原理向污水中加入聚乙二醇，聚乙二醇在一定盐浓度条件下可使病毒颗粒形成多聚体，在一定离心力下将水溶液与病毒颗粒多聚体分开，收集病毒颗粒多聚体形成的沉淀，用于后续核酸提取和实时荧光RT-PCR检测。7.1.2试剂和材料7.1.2.1试剂7.1.2.1.1聚乙二醇：分子生物学级，平均分子量8000。7.1.2.1.2氯化钠：分子生物学级。7.1.2.1.3无核酸酶水：分子生物学级。7.1.2.2材料7.1.2.2.1无菌带盖离心管：1.5mL，无核酸酶；50mL或250mL，可承受离心力≥12000g。7.1.2.2.2无菌移液器吸头：1mL，带滤芯，无核酸酶。7.1.2.2.3无菌移液管：50mL。7.1.3仪器设备7.1.3.1高速冷冻离心机：4℃，50mL或250mL转子，可承受离心力≥12000g。7.1.3.2电子天平：分辨力不低于0.001g。7.1.3.3生物安全柜：II级或II级以上。7.1.3.4高压灭菌器。7.1.3.5移液器：1mL。7.1.3.6大容量电动移液器。7.1.4富集浓缩步骤7.1.4.1预离心用大容量电动移液器分别移取3份35mL污水样本置于3个50mL离心管中，在4℃、2500g条件下离心30min，将上清液分别转移到另外3个50mL离心管中备用。剩余污水样本作为备份。注1：当污水样本悬浮物含量过高，可能影响病毒核酸提取和实时荧光RT-PCR检测时，应采用预离心弃除悬浮物后再进行后续操作。注2：若选用250mL离心管，可直接取105mL污水样本于250mL离心管中，在上述条件下离心后将上清液转移到另外1个250mL离心管中备用。7.1.4.2第二次离心在3个装有35mL污水样本或预离心后上清液的50mL离心管中分别加入3.5g±0.1g聚乙二醇和0.79g±0.01g氯化钠，充分混合，直至试剂完全溶解，该溶解过程约需15min。然后在4℃、12000g条件下离心120min，离心机降速时不应使用制动力。离心机停止后倾倒并弃除离心管中的上清液，至无上清液流出。注：若选用250mL离心管，在装有105mL污水样本或预离心后上清液的250mL离心管中操作时，聚乙二醇和氯化钠用量应等比例增加，其他操作相同。7.1.4.3富集浓缩7.1.4.3.1在4℃、12000g条件下将第二次离心后剩余的样本再次离心5min，离心机降速时不应使WS/T799—20223用制动力。离心机停止后用移液器从离心管中吸出并弃除剩余的上清液。7.1.4.3.2吸取0.4mL无核酸酶水加入到其中的一个离心管中，反复吹吸沉淀，瞬时离心，使所有液体聚集在管底，将混悬液吸出并加入到第二个离心管中。7.1.4.3.3重复吹吸沉淀和瞬时离心的操作后，再次将混悬液吸出并加入到第三个离心管中。7.1.4.3.4继续重复吹吸沉淀和瞬时离心的操作，最终形成的混悬液即为该水样的浓缩液，体积约为0.6mL。将浓缩液转移至1.5mL离心管中，于0℃～4℃条件下保存，并于24h内完成核酸提取和实时荧光RT-PCR检测。注：若选用250mL离心管，按照7.1.4.3.1条件再次离心并弃除剩余的上清液后，在离心管中加入0.4mL无核酸酶水，反复吹吸沉淀，并瞬时离心后即得到浓缩液。铝盐混凝沉淀法7.2.1原理向污水中加入铝盐混凝剂，铝盐水解产生的氢氧化铝胶体可吸附和包裹病毒颗粒，通过离心作用收集含病毒的胶体，然后通过化学溶解释放出包裹的病毒颗粒，用于后续核酸提取和实时荧光RT-PCR检测。7.2.2试剂和材料7.2.2.1试剂7.2.2.1.1实验用水：GB/T6682规定的一级水。7.2.2.1.2氯化铝溶液[c（AlCl3）=0.3mol/L]：称取4g无水氯化铝（纯度≥99%），置于烧杯中，加入100mL水，搅拌溶解后转移至试剂瓶中。7.2.2.1.3氢氧化钠溶液[c（NaOH）=1mol/L]：称取4g氢氧化钠（纯度≥96%），置于烧杯中，加入100mL水，搅拌溶解后转移至试剂瓶中。7.2.2.1.4盐酸溶液[c（HCl）=1mol/L]：移取43mL盐酸（分析纯，ρ20=1.19g/mL）于烧杯中，加入适量水，用玻璃棒搅拌混匀后转移至500mL容量瓶中，并定容至刻度。7.2.2.1.5乙二胺四乙酸二钠二水合物（C10H14N2O8Na2·2H2O）：纯度≥98%。7.2.2.2材料7.2.2.2.1无菌螺口锥形瓶：100mL。7.2.2.2.2无菌带盖离心管：10mL、50mL。7.2.2.2.3无菌移液器吸头：200μL、1mL，带滤芯，无核酸酶。7.2.2.2.4无菌移液管：50mL。7.2.3仪器设备7.2.3.1冷冻离心机：4℃，50mL转子，可承受离心力≥2500g。7.2.3.2恒温振荡培养箱。7.2.3.3电子天平：分辨力不低于0.001g。7.2.3.4pH计：精度≥0.01。7.2.3.5水浴锅。7.2.3.6生物安全柜：II级或II级以上。7.2.3.7高压灭菌器。7.2.3.8移液器：200μL、1mL。7.2.3.9大容量电动移液器。7.2.4富集浓缩步骤7.2.4.1预离心取大于50mL的污水样本在4℃、2500g条件下离心30min，留取上清液备用。剩余污水样本作为备份。注：当污水样本悬浮物含量过高，可能影响病毒核酸提取和实时荧光RT-PCR检测时，应采用预离心弃除悬浮物后再进行后续操作。WS/T799—202247.2.4.2富集浓缩7.2.4.2.1絮凝处理用大容量电动移液器将50mL污水样本或预离心后的上清液转移至100mL螺口锥形瓶中，加入0.5mL0.3mol/L的氯化铝溶液，用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调节水样pH=6.0±0.1。将螺口锥形瓶盖拧紧，置于恒温振荡培养箱中，以150r/min的速度在室温下混合15min。7.2.4.2.2离心分离将水样转移至50mL离心管中，在4℃、1900g条件下离心5min。7.2.4.2.3络合溶解倾倒弃除离心管中的上清液，在剩余胶体中加入0.20g±0.01g乙二胺四乙酸二钠二水合物，摇晃数十次至胶体变为液态，转移至10mL离心管中。将10mL离心管置于水浴锅中，60℃水浴10min。水浴后离心管中的液体即为该水样的浓缩液，体积约为1mL，于0℃～4℃条件下保存，并于24h内完成核酸提取和实时荧光RT-PCR检测。离心超滤法7.3.1原理选用嵌有超滤膜的超滤杯，通过离心作用将分子量大于超滤膜截留分子量的病毒颗粒截留在超滤杯内，收集超滤杯中的病毒浓缩液，用于后续核酸提取和实时荧光RT-PCR检测。7.3.2材料7.3.2.1一次性超滤杯：截留分子量为30kDa，体积为70mL，可倒置离心回收样本。7.3.2.2无菌带盖离心管：2mL，无核酸酶；50mL。7.3.2.3无菌移液器吸头：1mL，带滤芯，无核酸酶。7.3.2.4无菌移液管：50mL。7.3.3仪器和设备7.3.3.1冷冻离心机：4℃，50mL转子，可承受离心力≥6000g。7.3.3.2冷冻离心机：4℃，250mL水平转子，可承受离心力≥3000g。7.3.3.3生物安全柜：II级或II级以上。7.3.3.4高压灭菌器。7.3.3.5移液器：1mL。7.3.3.6大容量电动移液器。7.3.4富集浓缩步骤7.3.4.1预离心7.3.4.1.1用大容量电动移液器移取50mL污水样本于50mL离心管中，在4℃、5000g条件下离心30min，分别保留上清液和沉淀物。剩余污水样本作为备份。7.3.4.1.2取0.5mL上清液加入到保留沉淀物的离心管中，将沉淀物重悬混匀，保留待用。7.3.4.2富集浓缩7.3.4.2.1超滤杯前处理：取30mL无菌水加入到样品浓缩杯中，使用水平转子在4℃、2480g条件下离心10min，弃除滤液收集杯中的滤出液，再将样品浓缩杯反向倒置在浓缩液收集杯上，在4℃、920g条件下离心3min，弃除收集液。7.3.4.2.2将7.3.4.1.1预离心得到的上清液转移至样品浓缩杯中，使用水平转子在4℃、2480g条件下离心15min。如样品浓缩杯中残留液体体积较大，可适当延长离心时间，直至浓缩杯中液体约为0.3mL～0.6mL。7.3.4.2.3待全部上清液浓缩完成后，将样品浓缩杯反向倒置在浓缩液收集杯上，在4℃、920g条件下离心3min，吸取浓缩液