4月12号研讨会培训资料Millipore纯水-Moni

2010药典对实验纯水的新要求与密理博全面纯水解决方案FieldMarketingSpecialist朱文峰2010药典对实验纯水的新要求水中常见污染物及其所导致的试验问题分析Millipore的实验室用水解决方案2010药典对实验纯水的新要求药典中的水制药用水–饮用水•《生活饮用水卫生标准》•为药材净制时的漂洗、制药用具的粗洗用水。除另有规定外，也可作为药材的提取溶剂–纯化水•电导率（5.1μS/cm）,仪器精度应达到±0.1μs/cm•制药行业的主要实验基本用水–注射用水•由纯化水制得•电导率（1.3μS/cm）•TOC500ppb–灭菌注射用水•由注射用水制得•电导率（5μS/cm）•TOC500ppb《生活饮用水卫生标准》2007年7月，国家正式执行新的饮用水水质标准，新标准对饮用水水质的要求由原来的35项指标提高为106项，这是一项与国际接轨的水质标准。新的国家饮用水水质标准中增加的绝大部分指标是有机污染物控制指标。其中，微生物指标由2项增至6项；饮用水消毒剂指标由1项增至4项；毒理指标中无机化合物由10项增至21项；毒理指标中有机化合物由5项增至53项；感官性状和一般理化指标由15项增至20项；放射性指标仍为2项。药典中的实验检测用水各类实验检测方法中用到的实验用水–“总有机碳检查用水”•电导率1μS/cm；TOC100ppb–“HPLC实验用水”•超纯水（TOC10ppb、电导率0.055μS/cm）–“LC-MS实验用水”•ppb-ppt级别的检出限–“离子色谱实验用水”•“制备洗脱液的去离子水应经过纯化处理，在25℃下，电导率0.055μS/cm（电阻率一般大于18.2MΩ.cm）；样品前处理需要0.45μm滤膜过滤后直接进样分析”–“ICP-MS实验用水”•所用水应为去离子水（电阻率应不小于18MΩ.cm）–ICP-AES•试验用水应为去离子水（电导率应大于18.2MΩ.cm）以TOC检测实验为例TOC的检测-附录ⅧR制药用水中总有机碳测定法–检测方法：离线、在线均可，同时满足以下三个条件•区分无机碳和有机碳•满足系统适用性试验的要求•灵敏度:最低检出限为每升含碳等于或小于0.05mg/L(50ppb)–总有机碳检查用水•应采用每升含总有机碳低于0.10mg(100ppb)，电导率低于1.0μS/cm（25℃）的高纯水。–总有机碳检查用水的应用•离线TOC检测时。所使用的玻璃器皿必须严格清洗有机残留物，并用总有机碳检查用水做最后淋洗—必须的！•一些TOC检测仪器自身清洗，以及做空白使用—是必须的•离线检测时，取水及测定系统都须进行充分的清洗•系统校验实验以及系统适用性试验时的实验用水--必须的！如果总有机碳检查用水不符合药典要求–离线、在线TOC检测仪所得检测数据就不能够被认可–制药用水的品质就不能得到有效的保障有的药厂认为自身注射用水已经TOC100ppb,能否直接用其作为总有机碳检查用水–如果没有可认证的独立的纯化设备提供TOC100ppb的总有机碳检查用水，如何来检测、认定和保证你已有的注射用水符合药典要求？总有机碳检查用水必须满足以下条件–独立系统纯化–该系统配有在线、独立并且可校验认证的TOC在线检测仪确保水质以TOC检测实验为例大多数药厂QC实验用水现状作实验直接用注射用水•电导率（1.3μS/cm）•TOC500ppb桶装纯净水•大多TOC100ppb•电导率2μS/cm双蒸水•TOC200ppb•电导率1μS/cm这些水能满足新药典相关实验用超纯水的标准么？满足2010药典相关实验标准的实验用水水质应达到一级水•TOC5ppb•电导率0.056μS/cm水质有保障•能够有可校验可认证的检测设备监控实验用超纯水的水质•TOC监控•电阻率实时监控应当是独立的纯化系统•作为检验用水，应当是独立系统制备理想的实验室用水——GB6682-2000一级二级三级PH范围(25℃)--5.0-7.5电导率(25℃)，mS/cm≤0.010.100.50比电阻(25℃)，MΩ·cm≥1010.2可氧化物质，mg/L-0.080.40吸光度(254nm,1cm光程)≤0.0010.1-蒸发残渣(105±2℃)，mg/L-≤1.02.0可溶性硅(SiO2)mg/L＜0.010.02-理想的实验室用水——国际标准理想的实验室用水——MIlliporeContaminantParameter(unit)TypeIIITypeIITypeIIonsResistivity(M.cm)0.051.018.0OrganicsTOC(ppb)Pyrogens(Eu/mL)200NA500.25100.03ParticulatesParticulates0.2µm(units/mL)NANA1ColloidsSilica(ppb)100010010BacteriaBacteria(cfu/mL)10001001pHunit5.0-7.5NANA21世纪实验室超纯水的金标准电阻率(电导率)——18.2MΩ·cm(0.055mS/cm)，25℃；用于表征水中离子的含量TOC(总有机碳)——＜5ppb；用于表征水中有机物的含量，也是制药行业实验室用水中最为关注的指标水中常见污染物及其所导致的实验问题分析常见实验室问题配制的试剂容易变质HPLC分析药物时出现基线不稳、峰型劣化、保留时间变化等问题离子色谱分析时出现不明离子峰、离子浓度不稳定等问题疫苗研究过程中，通过凝胶电泳等对Vero细胞残余蛋白进行研究时电泳效果不理想用PCR法测定基因药物特定DNA时出现非预期的扩增条带或特异的扩增条带不明显基线(baseline)不稳定问题：基线不稳定会使定量分析难以进行灵敏度降低有机杂质与分析物竞争与固定相的活性区(activesites),使原本该结合的样品分子流出,导致波峰高度降低,积分面積減少及減少分析結果的灵敏度.寄生波峰parasitepeaks问题:何者才是正确的带分析分子？n°4或n°5?n°4n°4n°5误判重叠峰值保留时间改变问题:上下圈还是相同的波峰么?并且是相同的分子嗎?解析度降低水中的污染物颗粒离子气体微生物有机物HHH-C-C-OHHH颗粒阻塞过滤系统损坏泵系统吸附电荷影响离子浓度折射光线影响判读提供细菌滋生载体自来水中常见的盐阴离子阳离子Na+Ca++Al+++Mn++Fe++Pb+COCl-NO3-4PO---SO4--3--ClO-SiO4Si2O7......SiO2气体影响水的离子浓度和PH值直接参与反应影响水有效体积影响光学测定结果损耗仪器氧气氯气二氧化碳氡细菌活的细胞并有生长繁殖能力直径0.27µm到3.0µm(病毒0.04µm到0.1µm)水源,空气,人体都带菌细菌本身影响生物学实验裂解释放热原,酶等多种物质产生菌膜持续释放污染物堵塞仪器通道PseudomonasaeruginosaStreptococcuspyogenes有机物农药工业污染物（石油、纺织、化工等）生活废水动植物组织及其代谢物干扰有机分析的背景微生物滋生的营养物质包住去离子用的树脂需要关注的特殊有机物热原和RNA酶自然的和人造的热原和RNA酶热原也称为内毒素革兰氏阴性菌细胞壁分泌多糖刺激免疫系统产生发热高压灭菌180度4小时去除RNA酶主要作用是裂解RNARNA酶无处不在对高温酸碱都有耐受性可保持活性数周细胞培养,分子生物学类实验非常容易受到影响劣化水质的影响——一般实验试剂和缓冲液的保质期——纯水作为主要/重要溶剂，离子浓度、TOC、微生物过高会影响所配溶剂保质期，同时可能与溶质或混合溶剂发生反应影响实验进行微生物培养物配制——离子浓度过高影响微生物生长、TOC和微生物过高可能引入不明的有机物（如核酸酶、次生代谢产物等）管道供水、水浴和高压锅用水——结垢医用无菌水——高微生物和TOC引起热原的免疫反应BOD和COD检测仪——高TOC影响测定准确度溶解性实验——离子浓度、胶体等影响实验准确性紫外吸收分析——TOC可直接影响紫外光的吸收劣化水质的影响——分子生物学实验分子生物学应用——PCR、RT-PCR、电泳、印迹法等水质劣化影响①痕量核酸酶作用于DNA或RNA并对其进行水解，严重影响上述实验的精确度②重金属离子Fe,CdorZn等会干涉和影响聚合酶反应③有机物可能为非特异性DNA或RNA，并与PCR目标DNA或RNA竞争与聚合酶结合，此外有机物还可能与PCR目标DNA或RNA结合影响PCR反应④电泳缓冲液所用超纯水劣化可影响DNA浓度和电泳的速度从而使电泳结果偏离超纯水–自来水:直接荧光反应图像Millipore超纯水自来水用超滤技术制备的Milli-QAdvantage超纯水纯水－超纯水的比较琼脂糖凝胶电泳倒置荧光图像纯水（Elix）超纯水(MQAdvantage)水质劣化的影响——微生物学微生物学应用——细胞培养、细菌鉴定等水质劣化影响①细胞培养对重金属、某些有机物及细胞毒性物质均十分敏感②杂菌生长影响细菌的鉴定（单克隆培养、特定种属细菌的生化反应等）神经细胞培养该神经细胞是在人工合成培养基上进行培养的，因此可以清晰的比较出所用不同水的水质的影响用水包括–1)去离子水–2)去离子+蒸馏+无UF的Milli-Q系统处理水–3)(RO+EDI)水+Milli-QAdvantage+Biopak(具有UF+UV)结果表明，不但不同的水对细胞培养结果有影响，用同样的超纯水系统，配备不同的预处理系统得到的水，细胞培养结果也不相同劣化水质的影响——有机分析化学分析化学应用1、有机——HPLC、UPLC-MS、GC-MS等，用于样品制备、缓冲液配制、空白样品、标准样品制备2、水质劣化影响①基线过高，背景大，降低检出限！②峰形劣化，难以区分或定量！③堵塞或损坏色谱柱，导致系统高压，柱效下降，分离困难！④TOC过高会迅速造成进样口污染、电离困难、产生大量带电分子和碎片，严重影响仪器的灵敏度不同浓度TOC对ＨＰＬＣ基线的影响System:WatersAlliance2695Column:C18Symetry®Waters,4.6x150mm,3.5mmGradient:5%Acetonitrileinwaterto100%ACNin30min,then100%ACNWavelength:214nmWatersamples:60mLtraceenrichmentbyaccumulationonC18columnat1mL/minUltrapurewater20ppbUltrapurewater13ppbUltrapurewater9ppbUltrapurewater5ppbUltrapurewater2ppb水质劣化所致ＴＯＣ升高对LC-MS基线的影响TotalIonCountobtainedbymassspectrometryonwaterpurifiedbyaMilli-QGradientwithUVlamp03.46.810.213.617.0RetentionTime(min)1.0E+40102030405060708090100%IntensityUVoff:12ppbTOCviainternalmonitorOfforOnUVon:4ppbTOCviainternalmonitor水质劣化影响——无机分析化学分析化学应用1、无机——ICP-MS、离子色谱、原子吸收等，用于样品制备、缓冲液配制、空白样品、标准样品制备2、水质劣化影响①基线过高，背景大，降低检出限！②直接影响目标离子浓度！③溶液离子浓度不稳定，难以制作标准曲线！不同纯化技术制备纯水的阳离子色谱Ca2+Conductivity(µS/cm)TimeNa+Li+K+Mg2+1:Tapwater2:ROwater3:RO