SN∕T 5367.1-2022 商品化试剂盒检测方法 单核细胞增生李斯特氏菌 方法一

ICS07.100.30CCSX04中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5367.1—2022商品化试剂盒检测方法单核细胞增生李斯特氏菌方法一Commercialkitmethod-Listeriamonocytogenes-TestmethodⅠ2022-03-14发布2022-10-01实施中华人民共和国海关总署发布中华人民共和国出入境检验检疫行业标准商品化试剂盒检测方法单核细胞增生李斯特氏菌方法一SN/T5367.1—2022*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(100023)编辑部:[phone]-7530网址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张0.75字数22千字2022年月第一版2022年月第一次印刷印数1—*书号:155175·703定价12.00元前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件是SN/T5367《商品化试剂盒检测方法单核细胞增生李斯特氏菌》的第1部分。SN/T5367已经发布了以下部分:———第1部分:商品化试剂盒检测方法单核细胞增生李斯特氏菌方法一。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中国海关科学技术研究中心、中华人民共和国福州海关。本文件主要起草人:曾静、赵晓娟、刘莉、王紫薇、付溥博、徐蕾蕊、马丹、郑晶。ⅠSN/T5367.1—2022商品化试剂盒检测方法单核细胞增生李斯特氏菌方法一1范围本文件规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌的环介导恒温核酸扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)检测(3MMDS单增李斯特氏菌分子检测试剂盒)方法。本文件适用于乳制品、肉制品、鱼类和海产品中单核细胞增生李斯特氏菌的筛选检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB4789.30食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T2775商品化食品检测试剂盒评价方法SN/T3266食品微生物检验方法确认技术规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4生物安全措施为了保护实验室人员的安全和防止污染,应由具备资格的工作人员检测单核细胞增生李斯特氏菌。所有培养物、DNA提取物和废弃物应按照GB19489和GB/T27403中的有关规定执行。5技术概要应用环介导恒温核酸扩增(LAMP)技术进行单核细胞增生李斯特氏菌的筛选检测。根据单核细胞增生李斯特氏菌属特有靶序列上的6个独立区域,采用6条特异引物通过稳定的BstDNA聚合酶来驱动扩增反应,在60℃左右完成恒温扩增。在环介导恒温核酸扩增反应中,焦磷酸盐(PPi)通过ATP-硫酸化酶被转化成三磷酸腺苷(ATP)。荧光素酶利用ATP发光,实现实时检测。6试剂与材料除有特殊说明外,所有实验室用试剂均为分析纯,实验用水符合GB/T6682中一级水的规定。1SN/T5367.1—20226.13MMDS单核细胞增生李斯特氏菌分子检测试剂盒:本试剂盒参考SN/T2775和SN/T3266由国家认证认可监督管理委员会商品化食品检测试剂盒评价专家委员会组织评价。具体评价结果参见附录A。试剂盒避光储存于2℃~8℃,组成如下:a)裂解溶液(透明管中的粉红溶液LS管);b)扩增试剂管(含有冻干试剂小球,黄色试管);c)阳性对照(RC);d)盖子(黄色盖)。注:如商品化试剂盒关键技术指标发生变动时,以试剂盒说明书操作为准。6.2单核细胞增生李斯特氏菌质控菌株(ATCC13932)。6.3Demi-Fraser培养基(含柠檬酸铁铵):见B.1。6.4Fraser培养基(含柠檬酸铁铵):见B.2。6.53%84消毒液。7仪器和设备除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:a)3M分子检测仪器;b)移液器:量程10μL~100μL;c)水浴锅或加热模块:100℃±1℃;d)均质器;e)计时器;f)恒温培养箱:36℃±1℃;g)电子天平:感量0.1g。8检测程序食品中单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测程序见图1。2SN/T5367.1—2022图1食品中单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测程序9操作步骤9.1样品制备、增菌培养9.1.1将Demi-Fraser肉汤培养基温度平衡到室温。9.1.2以无菌操作取样品25g(mL)加入含有225mLDemi-Fraser肉汤增菌液的均质袋中,在拍击式均质器上连续均质2min,于36℃±1℃培养28h~30h;奶酪和鱼类样品需进行二次增菌,于36℃±1℃培养20h~24h,移取0.1mLDemi-Fraser肉汤增菌液转种于10mLFraser肉汤增菌液内,于36℃±1℃培养20h~24h。9.2细菌模板DNA的制备(裂解)从9.1获得的Demi-Fraser肉汤增菌液或Fraser肉汤增菌液,采用如下方法制备模板DNA。a)将裂解溶液(LS)管的温度平衡到室温。b)用移液器吸取20μL9.1.2中增菌液转移到LS管内。c)当加热模块的温度达到100℃±1℃时,将无盖LS管放在加热模块中加热15min±1min,随着温度的变化LS管中溶液的颜色会从粉红变为黄色。d)从加热模块中取出LS管,将其放在冷却架冷却5min~10min直至其颜色恢复为粉红色,即为模板DNA。3SN/T5367.1—20229.3环介导恒温核酸扩增(LAMP)反应9.3.1阴性对照、阳性对照设置每次反应必须设置阴性对照和阳性对照。阴性对照以无菌增菌培养基(如Demi-Fraser肉汤)替代DNA模板,请勿将水用做阴性对照。阳性对照为试剂盒提供的RC。每个样品设置两个平行反应。9.3.2扩增过程9.3.2.1吸取LS管中DNA模板20μL至扩增试剂管(含有冻干试剂小球),成一定角度缓慢加入,以避免搅动小球,轻轻上下吹吸5次,使小球溶解并充分混匀,加盖黄色盖子并确保盖子盖紧。9.3.2.2DNA模板添加顺序应为:待测样品、阴性对照和阳性对照,以避免交叉污染。9.3.2.3将反应管装进3M分子检测快速转移托盘,关闭并锁定托盘盖。9.3.2.4在3M分子检测软件中查看和确认配置的检测,在软件中单击启动按钮,仪器盖自动打开。9.3.2.5将3M分子检测快速转移托盘放入3M分子检测仪器并关闭盖,启动分析。9.3.2.6为了避免因为交叉污染而导致的假阳性结果,在分析完成后,将快速转移托盘浸入3%84消毒液1h,且始终远离分析准备区。9.4结果观察75min完成扩增,仪器实时自动报告检测结果,具体结果见附录C。10结果报告在阴性对照和阳性对照结果均有效的情况下:a)阳性结果,对样品增菌液进一步按照GB4789.30中操作步骤进行确认后报告检出单核细胞增生李斯特氏菌;b)阴性结果,报告未检出单核细胞增生李斯特氏菌;c)若与上述条件均不符,则本次结果无效,应更换试剂按本方法重新检测。4SN/T5367.1—2022附录A(资料性)单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测试剂盒评价结果1)1)本评价结果仅适用于3MMDS单增李斯特氏菌分子检测试剂盒。A.1包容性和排他性选择55株经确认的单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株和分离菌株,用LAMP试剂盒方法进行测试,结果全部为阳性。选择30株经确认的非单核细胞增生李斯特氏菌的标准菌株,用试剂盒方法进行测试,结果全部为阴性。A.2灵敏度、特异性、准确度及检出限选择5个食品种类,15个食品类型的样品,采用人工污染的方式分别制备未接种(L0)、低(L1)、高(L2)三个污染水平的试验样品,分别用LAMP方法和GB4789.30方法进行测试,相对灵敏度、特异性、准确度及检出限结果见表A.1。表A.1灵敏度、特异性、准确度及检出限序号食品基质相对灵敏度SE相对特异性SP相对准确度AC检出限(CFU/g)1乳粉100%100%100%0.192奶酪100%100%100%0.193肉制品100%100%100%0.194灭菌乳100%100%100%0.195鱼类和海产品100%100%100%0.19A.3耐变性分别对裂解时间(正常设置为15min)、裂解体积(正常设置为20μL)和反应体积(正常设置为20μL)三个变量进行耐变性实验,检测结果表明,在裂解时间变化2min、裂解体积变化2μL和反应体积变化2μL的情况下,对单增李斯特氏菌分子检测试剂盒方法的检出率没有影响。A.4批间变异取3个不同批号试剂盒分别对含目标菌和非目标菌样品进行批间差异实验,检测结果表明,该试剂盒无显著性批间差异。A.5评价结论试剂盒方法检测结果与参考标准方法检测结果无显著差异,能满足食品样品的检测要求。5SN/T5367.1—2022附录B(规范性)培养基和试剂B.1Demi-Fraser培养液(含柠檬酸铁铵)配方B.1.1成分氯化钠20g磷酸氢钠9.6g浓缩牛肉汁5.0g酪蛋白胰酶消化物5.0g动物组织胃蛋白酶消化物5.0g酵母抽提物5.0g氯化锂3.0g磷酸二氢钾1.35g马栗树糖1.0g盐酸吖啶黄0.0125g那利敌新锭0.01g柠檬酸铁铵(0.5g/10mL)10mL蒸馏水1000mLB.1.2制法将除柠檬酸铁铵以外的各成分加入蒸馏水中,搅混均匀,静置约10min,煮沸溶解,调节pH至7.2±0.2,高压灭菌121℃15min。待培养基温度冷至50℃以下时,按1000mL培养基内加10mL柠檬酸铁铵。B.2Fraser培养液(含柠檬酸铁铵)配方B.2.1成分氯化钠20g磷酸氢钠9.6g浓缩牛肉汁5.0g酪蛋白胰酶消化物5.0g动物组织胃蛋白酶消化物5.0g酵母抽提物5.0g氯化锂3.0g磷酸二氢钾1.35g马栗树糖1.0g盐酸吖啶黄0.025g那利敌新锭0.02g柠檬酸铁铵(0.5g/10mL)10mL蒸馏水1000mL6SN/T5367.1—2022B.2.2制法将除柠檬酸铁铵以外的各成分加入蒸馏水中,搅混均匀,静置约10min,煮沸溶解,调节pH至7.2±0.2,高压灭菌121℃15min。待培养基温度冷至50℃以下时,按1000mL培养基内加10mL柠檬酸铁铵。SN/T5367.1—2022SN/T5367.1—2022附录C(资料性)检测结果示意图检测结果示意图见图C.1。注:红色+为阳性结果,绿色-为阴性结果,阳性对照RC,阴性对照NC。图C.1单核细胞增生李斯特氏菌LAMP仪器检测结果2202—1􀏕7635T/NS版权专有侵权必究*书号:155175·703定价:12.00元