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ICS65.020.30CCSB41中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5477—2022布赫纳蝗螨检疫技术规范QuarantineprotocolforLocustacarusbuchneri2022-07-07发布2023-02-01实施中华人民共和国海关总署发布学兔兔—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国福州海关、中华人民共和国太原海关、中华人民共和国潍坊海关、中华人民共和国长春海关。本文件主要起草人:张体银、黄嫦娇、巩红霞、郑腾、王武军、田国宁、宋战昀、常亚琦、张志灯、于师宇。ⅠSN/T5477—2022学兔兔范围本文件规定了布赫纳蝗螨的形态学、聚合酶链式反应和实时荧光聚合酶链式反应检测方法。本文件适用于熊蜂中布赫纳蝗螨的检测和鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件:Ct循环阈值(Cyclethreshold)DNA脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid)dNTP三磷酸脱氧核苷酸(Deoxynucleosidetriphosphate)EB溴化乙锭(Ethidiumbromide)ITS内转录间隔区(Internaltranscribedspace)PCR聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction)TBE三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸(Trihydroxymethylaminomethane-boricacid-ethylenediaminetetraaceticacid)TE缓冲液Tris-EDTA缓冲液(Tris-EDTAbuffer)5设备、材料和试剂5.1设备5.1.1解剖显微镜。5.1.2高压灭菌锅。5.1.3PCR仪。5.1.4荧光PCR仪。5.1.5高速冷冻离心机(转速12000r/min)。1SN/T5477—2022学兔兔微量移液器。5.1.7生物安全柜。5.1.8DNA相对分子质量标准品(100bp~1000bp)。5.1.9水平电泳仪。5.1.10凝胶成像系统。5.1.11电子天平(感量0.01g)。5.1.12冰箱(2℃~8℃和-20℃)。5.2试剂5.2.1水:符合GB/T6682一级水的规格。5.2.2液氮。5.2.3乳酸。5.2.4无水乙醚。5.2.5无水乙醇。5.2.60.01mol/L磷酸盐(PBS)缓冲液,配制方法见附录A.1。5.2.710%SDS溶液,配制方法见附录A.2。5.2.8蛋白酶K。5.2.95mol/L的NaCl溶液,配制方法见附录A.3。5.2.10CTAB/NaCl溶液,配制方法见附录A.4。5.2.11三氯甲烷/异戊醇混合液,配制方法见附录A.5。5.2.12酚/三氯甲烷/异戊醇混合液,配制方法见附录A.6。5.2.13异丙醇。5.2.14TE缓冲液。5.2.1510×PCR缓冲液。5.2.16dNTPs(含dCTP、dGTP、dATP、dTTP)。5.2.17TaqDNA聚合酶。5.2.18琼脂糖。5.2.190.5×TBE缓冲液(配制方法见附录A.7)。5.2.20上样缓冲液(配制方法见附录A.8)。5.2.21核酸凝胶染料。5.2.22DNA相对分子质量标准物Marker。5.2.23DNA纯化回收试剂盒。5.3PCR引物上游引物Loc-F1:5'-AACCATTCTCTCAATTCACCT-3';下游引物Loc-R1:5'-TCGAAGAAGGATGTGTTGAAGT-3';根据布赫纳蝗螨线粒体细胞色素c氧化酶亚基I基因序列设计,扩增长度约为228bp,用双蒸水溶解至10μmol/L后,保存于-20℃备用。5.4实时荧光PCR引物和探针上游引物Loc-F2:5'-GGACCCAATCCTATTCCAGCA-3';下游引物Loc-R2:5'-TGTTGTGGAGATGTGTGATACG-3';TaqMan探针qPCR-P:FAM-TGATTCTTCGGACACCCAGAGGTCT-TAMRA;2SN/T5477—2022学兔兔基因序列设计,扩增长度约为103bp,用双蒸水溶解至10μmol/L后,保存于-20℃备用。5.5质控物质使用感染布赫纳蝗螨的熊蜂样品组织或含目的片段的DNA作为阳性对照;使用未感染布赫纳蝗螨的健康熊蜂样品组织作为阴性对照;用水作为空白对照。6采样6.1采样比例6.1.1当蜂群数量≤10群时,所有蜂群均采样。6.1.2当数量在11群~100群时,以10群采样量为基础,每增加10群,采样量增加1群。6.1.3当蜂群数量为101群~200群时,按总群数的15%采样。6.1.4当蜂群数量200群时,以200群采样量为基础,每增加20群,采样量增加1群。6.2采样方法从每个选定蜂群中采取活力较弱的熊蜂30只,放入烧杯内盖好,记录群号。检验前先将活蜂用乙醚处死或置于冰箱冷冻室内冷冻10min。7形态学检测7.1样品处理随机选取10只熊蜂,去除翅和足。将样品放入50mL量杯中,加入20mL水,10000r/min匀浆3次,每次30s,制成悬液,经0.8mm滤膜过滤,用水悬浮至20mL,滤液经2000r/min离心5min,弃去上清,在沉淀物中加入100μL乳酸,静置10min,用解剖显微镜观察。7.2镜检将处理好的样品进行解剖显微镜观察,根据布赫纳蝗螨若螨、成螨等各个时期的形态进行鉴别(基本信息及形态参见附录B和附录C)。7.3结果判定根据镜检观察到的形态特征的符合程度可初步判定为阴性或疑似阳性,再进一步进行PCR或荧光PCR试验。8PCR检测8.1设立对照从提取DNA开始,每个步骤均需设立阳性对照、阴性对照、空白对照。实验室检测条件应符合GB19489实验室生物安全通用要求中二级生物安全防护要求。8.2DNA的提取8.2.1每群选取3只~5只处死后的熊蜂或死后新鲜的熊蜂,用灭菌的剪刀剪取腹部组织,转入3SN/T5477—2022学兔兔研磨管中,置于样品制备仪进行研磨处理,也可直接选取可疑虫体及其宿主熊蜂进行研磨处理。8.2.2取研磨后的样本约25mg转移至另一1.5mL离心管中,加入50μLTE缓冲液,使样品充分悬浮后,加入60μL10%SDS溶液和10μL20mg/mL的蛋白酶K,混匀后于37℃下温育1h。8.2.3加入100μL5mol/L的NaCl溶液,上下颠倒充分混匀,加入80μLCTAB/NaCl溶液,混匀后65℃温育10min;加入700μL氯仿/异戊醇(体积比为24∶1),混匀后12000r/min离心5min。8.2.4吸取上清至另一干净离心管,加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(三者体积比为25∶24∶1),上下颠倒混匀,12000r/min离心5min。8.2.5吸取上清至另一干净离心管,加入2倍体积预冷的异丙醇沉淀DNA,轻轻混匀,4℃下12000r/min离心15min,彻底去除上清。8.2.6用600μL70%预冷的乙醇洗涤沉淀,4℃下12000r/min离心10min,弃上清,再瞬时离心,用移液器彻底吸除酒精,在超净工作台上自然晾干。8.2.7加入20μLTE缓冲液溶解DNA,-20℃下保存。8.2.8DNA提取也可选用等效的商品化试剂盒。8.3PCR扩增8.3.1反应体系普通PCR反应体系见表1。PCR扩增可以采用等效的商品化DNA扩增试剂盒。表1普通PCR反应体系名称工作浓度终浓度加样量10×PCR缓冲液10×1×2.5μLdNTPs10mmol/L0.2mmol/L0.5μLTaqDNA聚合酶5U/μL0.1U/μL0.5μL上游引物Loc-F110μmol/L0.4μmol/L1.0μL下游引物Loc-R110μmol/L0.4μmol/L1.0μL模板DNA——2.0μL水——17.5μL总体积——25μL注:反应体系中各试剂的量可根据反应体系总体积进行适当调整。8.3.2反应程序94℃预变性5min;之后94℃变性45s,55℃退火30s,72℃延伸45s,共35个循环;72℃补充延伸10min,4℃保温。8.4琼脂糖凝胶电泳用TBE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶,同时加入使用浓度的核酸凝胶染料。将凝胶放入水平电泳槽,使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6μL样品和2μL上样缓冲液按比例混匀后加入样品孔。在电泳时使用DNA相对分子质量标准品作对照。5V/cm电泳约0.5h,当指示剂到达底部时停止。4SN/T5477—2022学兔兔凝胶成像分析和测序将电泳完毕的凝胶用凝胶成像仪观察并判断结果,经核酸扩增电泳后如出现一条大小约228bp的DNA片段,应切胶回收DNA片段进行测序,也可直接送PCR产物进行测序。8.6结果判定经PCR扩增并电泳后阳性对照会出现一条大小约228bp的DNA片段,而阴性对照和空白对照无条带时,试验成立。待检样品经核酸扩增电泳后,出现大小约228bp的DNA条带并经测序验证,测序结果同参考序列(参见附录D.1)同源性要达到98%以上方可判为布赫纳蝗螨核酸阳性;无条带或条带的大小不是约228bp或条带的大小约228bp,但测序结果同参考序列同源性低于98%的判为布赫纳蝗螨核酸阴性。9实时荧光PCR9.1设立对照同8.1。9.2DNA提取同8.2。9.3实时荧光PCR扩增9.3.1反应体系实时荧光PCR反应体系见表2。实时荧光PCR扩增可以采用等效的商品化荧光定量PCR试剂盒。表2实时荧光PCR反应体系名称工作浓度终浓度加样量10×PCR缓冲液10×1×2.5μLdNTPs10mmol/L0.2mmol/L0.5μLTaqDNA聚合酶5U/μL0.1U/μL0.5μL上游引物Loc-F210μmol/L0.2μmol/L0.5μL下游引物Loc-R210μmol/L0.2μmol/L0.5μL探针qPCR-P10μmol/L0.2μmol/L0.5μL模板DNA——2.0μL水——18.0μL总体积——25μL注:反应体系中各试剂的量可根据反应体系总体积或不同仪器的要求进行适当调整。9.3.2反应程序95℃预变性5min;之后95℃变性15s,59℃退火30s,共40个循环。反应条件根据不同仪器型5SN/T5477—2022学兔兔标准下载号和试剂盒可进行调整。9.4结果判断9.4.1综合分析仪器给出的各项结果,基线以仪器给出的默认值作为参考,阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准,具体根据仪器噪音情况进行调整,选择FAM通道进行分析。9.4.2阳性对照样品有对数扩增曲线,而且Ct值≤30;阴性对照和空白对照无扩增曲线且未检出,二者均成立才可判定试验成立。9.4.3检验样本Ct值≤35时,报告布赫纳蝗螨核酸阳性。9.4.4检验样本35Ct值≤40时,重复提取核酸并进行荧光PCR扩增一次,如果Ct值仍然≤40,并且曲线有明显的对数增长期,报告布赫纳蝗螨核酸阳性,否则报告布赫纳蝗螨核酸阴性。10综合判定无论形态学检测结果为阴性、疑似阳性或者未进行形态学检测,PCR和/或实时荧光PCR方法检测为阳性,均判为布赫纳蝗螨阳性。6SN/T5477—2022学兔兔