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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜０６７３—２０１１代替ＳＮ／Ｔ０６７３—１９９７进出口肉及肉制品中盐霉素残留量检测方法 酶联免疫法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犛犪犾犻狀狅犿狔犮犻狀狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犿犲犪狋犪狀犱犿犲犪狋狆狉狅犱狌犮狋狊犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犈狀狕狔犿犲犾犻狀犽犲犱犻犿犿狌狀狅狊狅狉犫犲狀狋犪狊狊犪狔２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准进出口肉及肉制品中盐霉素残留量检测方法 酶联免疫法ＳＮ／Ｔ０６７３—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张０．５ 字数９千字２０１１年６月第一版 ２０１１年６月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２１５８ 定价１４．００元书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ０６７３—１９９７《出口肉及肉制品中盐霉素残留量检验方法 滤纸片法》。本标准与ＳＮ／Ｔ０６７３—１９９７相比，主要技术变化如下：———将原标准的检测方法 滤纸片法变更为酶联免疫法；———将原标准中文名称《出口肉及肉制品中盐霉素残留量检验方法 滤纸片法》修订为《进出口肉及肉制品中盐霉素残留量检验方法 酶联免疫法》；———修改了适用的范围；———删除了原标准的抽样内容。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局，中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：赵良娟、贺艳、孙哲平、张宏伟、郑文杰、赵宏、高旗利、候丽萍、闫煜。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ０６７３—１９９７。Ⅰ犛犖／犜０６７３—２０１１进出口肉及肉制品中盐霉素残留量检测方法 酶联免疫法１ 范围本标准规定了进出口肉及肉制品中盐霉素残留量的酶联免疫测定方法。本标准适用于进出口鸡肉中盐霉素残留量的检测，其他肉及肉制品可参照执行。２ 试剂和材料除另有规定外，所用化学试剂均为分析纯，或为更高级别。水为去离子水。２．１ 盐霉素酶联免疫定量测定试剂盒１）（参见附录Ａ）。１） 给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品操作步骤的认可。如果其他产品的操作步骤有不同，需经实验评估后采用。２．２ 甲醇。２．３ 氯化钠。２．４ 二氯甲烷。２．５ 氢氧化钠。２．６ ８％的氯化钠溶液：称取８．０ｇ氯化钠加去离子水溶解定容至１００ｍＬ。２．７ 甲醇８％氯化钠溶液：８０ｍＬ甲醇加入到２０ｍＬ８％的氯化钠溶液中混匀。２．８ ０．５ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠８％氯化钠溶液：称取２．０ｇ氢氧化钠加８％氯化钠溶液溶解定容至１００ｍＬ。２．９ 复溶工作液：用去离子水将２×浓缩复溶液按１∶１体积比进行稀释。４℃环境可保存１个月。２．１０ 洗涤工作液：用去离子水将２０×浓缩洗涤液按１∶１９体积比进行稀释。４℃环境可保存１个月。２．１１ 盐霉素标准品：标准品纯度≥９８％。２．１２ 盐霉素标准品溶液的配制：准确称取适量的盐霉素标准品，用复溶工作液配制成１ｍｇ／ｍＬ标准贮备溶液，于４℃～８℃条件下保存。３ 仪器和设备３．１ 酶标仪：波长４５０ｎｍ。３．２ 匀浆机。３．３ 振荡器。３．４ 天平：量程２ｋｇ，感量０．１ｇ。３．５ 离心机：５０００犵。３．６ 氮气吹干仪。３．７ 洗板机。３．８ 微量加样器：２０μＬ、５０μＬ、１００μＬ、２００μＬ。３．９ 微量多通道加样器：５０μＬ、１００μＬ。１犛犖／犜０６７３—２０１１４ 试样的制备和保存４．１ 试样的制备从所取全部样品中取出有代表性样品约１ｋｇ，充分搅碎，混匀，采用四分法，将样品分成两等份，装入洁净容器，加封并做标识。４．２ 试样的保存试样放置－２０℃～－１８℃条件下保存。５ 测定方法５．１ 方法提要本方法的测定基础是间接竞争性酶联免疫反应，样本中的盐霉素与微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗盐霉素抗体，加入酶标二抗后，用ＴＭＢ底物显色，样本吸光值与其所含盐霉素的含量成负相关，按绘制的校正曲线定量计算即可得出盐霉素的含量。５．２ 样品处理称取２．０ｇ试样均质物至离心管中，加入８ｍＬ甲醇８％氯化钠溶液，剧烈振荡５ｍｉｎ，４５００犵以上离心１０ｍｉｎ；移取２ｍＬ上清液加入４ｍＬ０．５ｍｏＬ／Ｌ氢氧化钠８％氯化钠溶液，混合均匀，再加入１０ｍＬ二氯甲烷，振荡５ｍｉｎ，４５００犵离心１０ｍｉｎ；除去上层，取下层５ｍＬ至试管中，于５０℃～６０℃水浴氮气吹干；用１ｍＬ复溶工作液溶解干燥的残留物；取５０μＬ用于分析。５．３ 酶联免疫法测定５．３．１ 操作条件所有操作应在室温下（２０℃～２５℃）进行，盐霉素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温（２０℃～２５℃）后方可使用。５．３．２ 测定步骤测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头。在酶标板中分别加入５０μＬ不同浓度的盐霉素标准溶液和样品待测液；每个标准溶液和样品待测液均做２孔平行。再在每个孔中加入５０μＬ的抗体工作液；轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后，室温避光反应３０ｍｉｎ。弃掉酶标板中的液体，用洗涤工作液２５０μＬ／孔充分洗板４次～５次。每孔再加入１００μＬ酶标二抗，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后，室温避光反应３０ｍｉｎ。弃掉酶标板中的液体，用洗涤工作液重复洗板４次～５次。每孔加入底物液Ａ液５０μＬ，再加底物液Ｂ液５０μＬ，轻轻振荡混匀，室温避光反应１５ｍｉｎ后，每孔加入终止液５０μＬ，轻轻振荡混匀，５ｍｉｎ内在酶标仪上读出每孔４５０ｎｍ吸光值。５．３．３ 空白试验除不称取试样外，均按上述步骤进行。２犛犖／犜０６７３—２０１１５．４ 结果表述百分吸光率的计算：标准品或样本的吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（０标准）的吸光度值，再乘以１００％，见式（１）：吸光度值＝犅／犅０×１００％………………………………（１） 式中：犅———标准溶液或样本溶液的平均吸光度值；犅０———０μｇ／ｋｇ标准溶液的平均吸光度值。以标准品吸光率为纵坐标，以盐霉素标准品浓度（μｇ／ｋｇ）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中盐霉素实际残留量。也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算，所得结果表示至一位小数。５．５ 检测限、回收率５．５．１ 检测限本方法的检测限为２０μｇ／ｋｇ。５．５．２ 回收率本方法中盐霉素添加浓度及回收率的试验数据：———添加浓度为１０μｇ／ｋｇ时，平均回收率为７６％；———添加浓度为２０μｇ／ｋｇ时，平均回收率为８５．５％；———添加浓度为５０μｇ／ｋｇ时，平均回收率为８３％；———添加浓度为１００μｇ／ｋｇ时，平均回收率为８５．２％。５．６ 确证试验如被测样品中盐霉素残留量的值大于检测限时，应用其他方法进行确证。犛犖／犜０６７３—２０１１书书书犛犖／犜０６７３—２０１１附 录 犃（资料性附录）盐霉素酶联免疫定量测定试剂盒犃．１ 盐霉素酶联免疫定量测定试剂盒本标准酶联免疫测定步骤中使用的试剂盒包括：———９６孔酶标板×１块（包被有偶联抗原）；———标准液：０μｇ／ｋｇ，１μｇ／ｋｇ，３μｇ／ｋｇ，９μｇ／ｋｇ，２７μｇ／ｋｇ，８１μｇ／ｋｇ；———高浓度盐霉素标准品：１ｍｇ／ｋｇ；———酶标二抗；———抗体工作液；———底物液Ａ液；———底物液Ｂ液；———终止液；———２０×浓缩洗涤液；———２×浓缩复溶液。犃．２ 盐霉素标准曲线盐霉素标准曲线见图Ａ．１。图犃．１ 盐霉素标准曲线１１０２—３７６０犜／犖犛书号：１５５０６６·２２２１５８定价： １４．００元