T∕CPMA 009-2020 艾伯特埃希菌分离及鉴定方法

ICS11.020C05团体标准T/CPMA009—2020艾伯特埃希菌分离及鉴定方法IsolationandidentificationofEscherichiaalbertii2020-07-01发布2020-10-01实施中华预防医学会发布T/CPMA009-2020I目次前言....................................................................................................................................................................II引言..................................................................................................................................................................III1范围..............................................................................................................................................................12术语和定义..................................................................................................................................................13缩略语..........................................................................................................................................................14设备和材料..................................................................................................................................................25培养基和试剂..............................................................................................................................................26分离和鉴定程序..........................................................................................................................................37操作步骤......................................................................................................................................................48生物安全......................................................................................................................................................6附录A（资料性附录）艾伯特埃希菌病原学............................................................................................7附录B（规范性附录）培养基和试剂........................................................................................................9附录C（规范性附录）eae、cdtB、stx2毒力基因检测和MLST分析...................................................13参考文献..........................................................................................................................................................17T/CPMA009-2020II前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华预防医学会归口。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所、四川省自贡市疾病预防控制中心、四川大学华西公共卫生学院、四川省自贡市第四人民医院、国家食品安全风险评估中心。本标准主要起草人：熊衍文、王红、李群、郑翰、裴晓方、许欣、宋自阆、白莉。T/CPMA009-2020III引言艾伯特埃希菌（Escherichiaalbertii）是近年来发现和命名的埃希菌属中的一个新种，是与人散发肠道感染及食源性腹泻暴发事件有关的肠道致病菌。艾伯特埃希菌作为新发传染病病原菌，目前尚缺乏区别于其他肠道致病菌，特别是缺乏区别于大肠埃希菌的特异性生化表型，且商品化的细菌生化系统和质谱均不能鉴定艾伯特埃希菌，易造成误检和漏检。目前国内外尚无艾伯特埃希菌细菌分离、种属鉴定方面的相关标准。本标准在参考国外研究进展的基础上，经系统性试验优化后提出了艾伯特埃希菌的细菌分离、初步筛选和菌株确证的方法。T/CPMA009-20201艾伯特埃希菌分离及鉴定方法1范围本标准规定了艾伯特埃希菌的分离和鉴定方法。本标准适用于粪便、食品中艾伯特埃希菌的检验。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1艾伯特埃希菌Escherichiaalbertii肠杆菌科埃希菌属中的一个种，革兰阴性杆菌，主要生化特征为无动力，吲哚阴性，不发酵乳糖及木糖，可引起以腹泻为主要临床表现的胃肠道感染。注：详细资料参见附录A。3缩略语下列缩略语适用于本文件。PCR：聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)clpX：Clp蛋白酶ATP结合亚单位基因(ATP-bindingsubunitofClpproteasegene)lysP：赖氨酸特异性通透酶基因(Lysine-specificpermeasegene)mdh：苹果酸脱氢酶基因(Malatedehydrogenase)eae：大肠埃希菌粘附抹平效应基因(Escherichiacoliattachingandeffacing)cdtB：细胞致死膨胀毒素B亚单位基因(CytolethaldistendingtoxinsubunitB)stx2a：志贺毒素2a亚型基因(Shigatoxinsubtype2a)stx2f：志贺毒素2f亚型基因(Shigatoxinsubtype2f)MLST：多位点序列分型(Multi-locussequencetyping)EPEC：肠致病性大肠埃希菌(EnteropathogenicEscherichiacoli)EHEC：肠出血性大肠埃希菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli)STEC：产志贺毒素大肠埃希菌(Shigatoxin-producingEscherichiacoli)4设备和材料4.1电子天平：感量0.1g和0.01g。4.2恒温培养箱：36℃±1℃。4.3恒温生化培养箱：20℃±1℃。T/CPMA009-202024.4光学显微镜：10×~100×。4.5冰箱：2℃~8℃。4.6金属浴：95℃~100℃。4.7均质器。4.8振荡器。4.9pH计或精密pH试纸。4.10低温高速离心机。4.11PCR仪。4.12水平电泳仪：包括电源、电泳槽、胶槽和梳子。4.13凝胶成像系统。4.14微量移液器：量程10μL、200μL和1000μL。4.15电动移液器。4.16无菌刻度吸管：10mL。4.17无菌培养皿：直径90mm。4.18无菌均质袋：容量500mL。4.19无菌锥形瓶：容量500mL。4.20无菌容量瓶：容量100mL。4.21无菌微量离心管：1.5mL。4.22无菌试管：2mL、15mL和50mL。4.23无菌接种环。4.24无菌吸头：10μL、200μL和1000μL。4.25无菌平盖PCR管：0.2mL。5培养基和试剂5.1艾伯特埃希菌增菌液：见附录B.1。5.2麦康凯（MAC）琼脂：见附录B.2。5.3LB琼脂：见附录B.3。5.4乳糖发酵管：见附录B.4。5.5木糖发酵管：见附录B.5。T/CPMA009-202035.6半固体琼脂：见附录B.6。5.7灭菌去离子水。5.8灭菌生理盐水。5.9PCR试剂：包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、PCR反应缓冲液。5.10特异性PCR引物：见表1。5.115×TBE电泳缓冲液：见附录B.7。5.12琼脂糖。5.13溴化乙锭（EB）或其他替代核酸染料。5.146×DNA上样缓冲液：见附录B.8。5.15DNA分子量标准（DNAMarker）：范围100bp~1000bp。5.16革兰染色液：见附录B.9~B.11。5.17氧化酶试剂：见附录B.12。6分离和鉴定程序艾伯特埃希菌分离及鉴定程序见图1。图1艾伯特埃希菌分离及鉴定程序注：虚框部分为选做内容。T/CPMA009-202047操作步骤7.1样品制备7.1.1人畜粪便样品取0.5g粪便样品于含5mL艾伯特埃希菌增菌液的试管中，震荡混匀。7.1.2食品样品固体或半固态样品，以无菌操作称取检样25g，加入装有225mL艾伯特埃希菌增菌液的均质袋中，用拍击式均质器均质1min~2min；液体样品，无菌操作量取检样25mL，加入装有225mL艾伯特埃希菌增菌液的无菌锥形瓶中，震荡混匀。7.2增菌将6.1中制备的样品匀液，置恒温生化培养箱20℃±1℃培养18h~24h。7.3细菌分离用无菌接种环取增菌液划线接种MAC琼脂平板，于恒温培养箱36℃±1℃培养18h~24h。艾伯特埃希菌不发酵乳糖，其典型菌落较大、凸起、边缘整齐、无色或淡粉色。艾伯特埃希菌革兰染色阴性，氧化酶试验阴性。注：腹泻患者粪便可直接划线接种MAC琼脂平板。7.4初筛试验挑取MAC平板上可疑菌落10个以上（10个以下全选），分别同时接种乳糖发酵管、木糖发酵管、半固体琼脂及LB琼脂平板，于恒温培养箱36℃±1℃培养18h~24h。不发酵乳糖、不发酵木糖及无动力菌株为艾伯特埃希菌初筛阳性。7.5PCR确证试验7.5.1核酸模板制备用接种环挑取LB琼脂平板上对应的初筛阳性单菌落至100μL无菌去离子水中，混匀后于100℃加热10min，冷却后13000r/min离心5min，上清液即为PCR检测的模板。7.5.2PCR反应体系10×PCR反应缓冲液（含Mg2+）5µL，5U/µLTaqDNA聚合酶0.5µL，10µmol/L上/下游引物（见表1）各1µL，10mmol/LdNTPs2µL，DNA模板2µL，无菌去离子水34.5µL，总体积50µL。表1艾伯特埃希菌三重PCR确证试验引物引物名称引物序列（5′-3′）扩增产物长度（bp）clpX-FTGGCGTCG