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书书书犐犆犛０７．０８０犃２１中华人民共和国国家标准犌犅／犜３８０９３—２０１９β内酰胺类抗生素高分子聚合物测定凝胶色谱法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲犺犻犵犺犿狅犾犲犮狌犾犪狉狆狅犾狔犿犲狉狊犻狀β犾犪犮狋犪犿犪狀狋犻犫犻狅狋犻犮狊—犌犲犾犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔２０１９１０１８发布２０１９１０１８实施国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由中国标准化研究院提出并归口。本标准起草单位：中国计量大学、中国标准化研究院、北京萨姆伯科技有限公司。本标准主要起草人：许益鹏、叶子弘、俞晓平、马爱进、申屠旭萍、张雅芬、崔海峰、郝帅。Ⅰ犌犅／犜３８０９３—２０１９β内酰胺类抗生素高分子聚合物测定凝胶色谱法１ 范围本标准规定了用凝胶色谱法测定β内酰胺类抗生素中高分子聚合物的方法。本标准适用于青霉素Ｖ钾、头孢曲松、头孢噻吩、头孢拉定、头孢呋辛、头孢哌酮、头孢唑林、头孢替唑、苯唑西林、盐酸普鲁卡因１０种β内酰胺类抗生素研制和生产中内源性高分子聚合物的测定。本方法检出限为０．０８μｇ。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法３ 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１内源性高分子聚合物 犲狀犱狅犵犲狀狅狌狊犺犻犵犺犿狅犾犲犮狌犾犪狉狆狅犾狔犿犲狉狊β内酰胺类抗生素分子自身聚合而成的一类高分子物质。４ 原理根据相对分子质量的大小，利用高效凝胶色谱柱对β内酰胺类抗生素及其高分子聚合物进行分离，经紫外检测器在２５４ｎｍ测定，以色谱峰保留时间定性，以峰面积进行定量。５ 试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。５．１ 水：ＧＢ／Ｔ６６８２，一级水。５．２ 乙腈（犆犎３犆犖）：ＨＰＬＣ级。５．３ ５犿犿狅犾／犔磷酸盐缓冲液，狆犎７．０：准确称取０．４３２ｇ的磷酸氢二钠和０．３１２ｇ的二水合磷酸二氢钠，用９５０ｍＬ水溶解，调整ｐＨ为７．０，加水定容到１Ｌ，０．２２μｍ孔径的滤膜过滤。５．４ β内酰胺类抗生素：纯度≥９８％。６ 仪器设备６．１ 高效液相色谱仪：配紫外检测器。１犌犅／犜３８０９３—２０１９６．２ 高效凝胶色谱柱：粒径为５μｍ，孔径１２ｎｍ的硅胶基质，长度３０ｃｍ，内径７．８ｍｍ，理论塔板数１００００以上。６．３ 电子天平：感量为０．００１ｇ。６．４ 溶剂过滤系统：滤膜孔径为０．２２μｍ。７ 测定步骤７．１ 样品制备按需称取一定量的抗生素样品，根据样品的溶解特性，易溶于水的样品用５ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液进行溶解，微溶于水或难溶于水的样品用乙腈或乙腈和５ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液的混合液溶解，并用０．２２μｍ孔径的滤膜过滤。青霉素Ｖ钾、头孢曲松、头孢噻吩、头孢拉定、头孢呋辛、头孢替唑、苯唑西林和盐酸普鲁卡因用５ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液进行溶解；头孢哌酮和头孢唑林用体积比为１∶１的５ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液和乙腈的混合液溶解。７．２ 色谱条件色谱仪为高效液相色谱仪，色谱柱为高效凝胶色谱柱，等度洗脱，流动相为体积比为９０∶１０的５ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液与乙腈的混合液，流速为０．８ｍＬ／ｍｉｎ，进样体积为１０μＬ，柱温为２５℃，检测波长为２５４ｎｍ。７．３ 标准曲线的制作将抗生素标准品按梯度溶解、稀释后，配制成５个以上浓度梯度的标准品溶液。将配好的标准品溶液由低浓度到高浓度依次进样，以浓度为横坐标，以抗生素标准品主成分对应的峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，选择线性回归拟合程度犚２值在０．９５以上的５个连续浓度梯度，建立标准曲线。青霉素Ｖ钾的线性浓度范围为０．０４ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬ；头孢曲松的线性浓度范围为０．００５ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬ；头孢噻吩的线性浓度范围为０．００８ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬ；头孢拉定的线性浓度范围为０．０４ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬ；头孢呋辛的线性浓度范围为０．００１６ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬ；头孢哌酮的线性浓度范围为０．００１６ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬ；头孢唑林的线性浓度范围为０．０６５ｍｇ／ｍＬ～２．５ｍｇ／ｍＬ；头孢替唑的线性浓度范围为０．００１６ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬ；苯唑西林的线性浓度范围为０．００１６ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬ；盐酸普鲁卡因的线性浓度范围为０．０４ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬ。７．４ 试样溶液测定根据标准曲线，将试样按７．１进行溶解，使得其浓度落在标准曲线的浓度范围内进行测定。８ 结果分析按式（１）计算：犃１＝１００－犛Ａ１×ρＡ０犛Ａ０×犞Ａ１×１００犿…………………………（１） 式中：犃１———抗生素试样中高分子聚合物含量，％；犛Ａ１———抗生素试样中主成分的峰面积；ρＡ０———抗生素标准品中主成分峰面积所对应的质量浓度，单位为毫克每毫升（ｍｇ／ｍＬ）；２犌犅／犜３８０９３—２０１９犛Ａ０———抗生素标准品中主成分的峰面积；犞Ａ１———抗生素试样溶液体积，单位为毫升（ｍＬ）；犿———抗生素试样总量，单位为克（ｇ）。以平行样的平均值为最终的含量值，计算结果保留到小数点后两位。９ 重复性在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１０％。犌犅／犜３８０９３—２０１９