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ICS11.080CCSC59WS中华人民共和国卫生行业标准WS/T798—2022消毒剂消毒效果定性试验标准应用稀释法Qualitativetestingstandardondisinfectioneffectofdisinfectant——usedilutionmethod2022-01-24发布2022-06-01实施中华人民共和国国家卫生健康委员会发布ＷS/T798—2022I目 次前言.....................................................................................................................................................................II1范围.................................................................................................................................................................12规范性引用文件.............................................................................................................................................13术语和定义.....................................................................................................................................................14试验材料.........................................................................................................................................................15染菌载体的制备.............................................................................................................................................26中和剂鉴定试验.............................................................................................................................................37杀菌试验.........................................................................................................................................................58结果判定.........................................................................................................................................................59注意事项.........................................................................................................................................................6附录A（规范性附录）培养基和试剂............................................................................................................7ＷS/T798—2022II前 言本标准由国家卫生健康标准委员会消毒标准专业委员会负责技术审查和技术咨询，由中国疾病预防控制中心负责协调性和格式审查，由国家卫生健康委综合监督局负责业务管理、法规司负责统筹管理。本标准起草单位：北京市疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、中国人民解放军疾病预防控制中心。本标准主要起草人：佟颖、于礼、沈瑾、魏秋华、王劲、韩杰、安伟、肖潇、高迪。ＷS/T798—20221消毒剂消毒效果定性试验标准应用稀释法1范围本标准规定了消毒剂消毒效果定性试验应用稀释法的试验材料、染菌载体的制备、中和剂鉴定试验、杀菌试验、结果判定和注意事项。本标准适用于消毒剂对光滑硬质物体表面的实验室定性消毒效果评价。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。WS/T683消毒试验用微生物要求3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1应用稀释法usedilutionmethod采用定性方法评价消毒剂对不锈钢圆筒载体上试验微生物杀灭效果的检测方法。4试验材料4.1试验微生物4.1.1金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)作为细菌繁殖体中化脓性球菌的代表，试验菌种为ATCC6538。4.1.2铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)作为医院感染中常见分离的细菌繁殖体的代表，试验菌种为ATCC15442。4.1.3肠炎沙门菌(Salmonellaenterica)，试验菌种为ATCC10708。4.2培养基4.2.1传代培养基营养肉汤或合成肉汤培养基，用于细菌传代培养，见附录A。4.2.2中和试验培养基4.2.2.1基础培养液：营养肉汤或液体硫乙醇培养基，作为中和试验的基础培养基，见附录A。ＷS/T798—202224.2.2.2中和剂培养液：根据消毒剂有效成分选择相应中和剂加入基础培养基液中制备成为中和剂培养液，中和剂培养液需经中和剂鉴定试验验证合格后方可使用。4.2.3其他培养基胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），用于染菌载体的菌落计数，见附录A.5。4.3其他试剂和材料4.3.1磷酸盐缓冲液(见附录A.6)。4.3.2标准硬水(见附录A.7)。4.3.3有机干扰物：采用3%牛血清白蛋白；如为清洁物品采用0.3%牛血清白蛋白。4.3.4载体：304不锈钢圆筒，表面抛光，外径8mm±1mm，内径6mm±1mm，壁厚1mm±0.5mm，长度10mm±1mm。4.3.5吊钩：长度为50mm～75mm，直径为0.5mm的镍铬合金丝，末端3mm呈直角弯曲。4.3.6滤纸：直径为90mm的定性滤纸。4.3.7器皿：25mm×100mm玻璃试管，直径为90mm的平皿，10mL吸管，移液器等。4.4仪器设备Ⅱ级及以上生物安全柜、恒温培养箱、振荡培养箱、恒温水浴箱、计时器等。5染菌载体的制备5.1载体准备5.1.1外观检查载体经肉眼观察合格，方可使用。如有可见破损如钝化、缺口、凹陷或凿孔等应剔除。5.1.2清洗将载体置于1mol/LNaOH溶液中浸泡约12h，用去离子水反复冲洗3次～4次，收集冲洗水加入2滴～3滴1%酚酞溶液，如酚酞变为粉红色，表明有NaOH残留，需要继续冲洗至酚酞不变色，将载体晾干后密闭保存。5.1.3筛选测试5.1.3.1测试要求未使用过或使用过但试验中无菌生长的载体，不需进行筛选测试，经压力蒸汽灭菌后可使用。使用过的载体且在试验中有菌生长，应进行筛选测试，测试合格方可使用。5.1.3.2测试方法按照7.1规定，在无有机干扰物条件下，选用500mg/L苯扎氯铵消毒液对铜绿假单胞菌消毒作用10min，以Letheen肉汤作为中和剂培养液，对每个载体进行杀菌试验。5.1.3.3测试结果判断无菌生长为载体筛选测试合格，测试管中有菌生长，则该载体不合格。ＷS/T798—202235.1.4灭菌载体染菌前，将清洗后的载体放入试管中，加入去离子水至载体完全浸没，经压力蒸汽灭菌后，冷却至室温备用。5.2菌悬液的制备5.2.1参照WS/T683的规定复苏菌种，接种于含10mL营养肉汤或合成肉汤的试管中，经36℃±1℃，200r/min±20r/min振荡培养24h±2h，此为第1代培养物。5.2.2用移液器取第1代培养物10μL转种于含10mL营养肉汤或合成肉汤的试管中，经36℃±1℃，200r/min±20r/min振荡培养24h±2h，此为第2代培养物，可继续传代培养至第5代。5.2.3用移液器取第1～5代的24h新鲜培养物10μL转种于10个含10mL营养肉汤或合成肉汤的试管中，经36℃±1℃静置培养48h～56h后备用。5.2.4铜绿假单胞菌培养物应去除培养菌液表面的菌膜，或使用10mL吸管直接从溶液中部吸取菌液，放入另一个试管中。不可使用含菌膜的菌悬液进行试验。5.2.5将金黄色葡萄球菌、肠炎沙门菌和去除菌膜的铜绿假单胞菌培养菌液用电动混匀器振荡混合20s，室温静置10min后，用10mL吸管吸取上层四分之三的菌液转移至新的试管中混匀，以去除细菌碎片和团块，菌悬液于4℃冷藏保存备用，于30min内使用。5.2.6根据消毒剂的检测要求，按照WS/T683的规定加入有机干扰物。5.3载体染菌5.3.1每次试验时取80个无菌载体染菌，首先向4个无菌试管（25mm×100mm）中分别加入20mL制备好的菌悬液，依次向每管菌液中加入20个干燥无菌载体，确保载体完全浸没于菌液中，持续15min±2min。5.3.2用灭菌后的吊钩取出载体，轻触管壁去除多余菌液，垂直放置于无菌的双层滤纸上，置36℃±1℃恒温培养箱内干燥40min±2min后，于2h内进行试验。5.4染菌载体菌落计数5.4.1随机挑选2个染菌载体，分别放入2个含10mL营养肉汤的50mL离心管中，用电动混匀器剧烈振荡混匀20s进行洗脱，使用磷酸盐缓冲溶液进行10倍系列稀释。5.4.2选择适宜的稀释度,吸取1mL加入无菌平皿中，将冷却至40℃～45℃的熔化营养琼脂培养基，倾注于平皿中，平行接种于2个平皿，置36℃±1℃恒温培养箱中培养48h±2h后进行菌落计数。5.4.3每个染菌载体上金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的回收菌量为1.0×106CFU/载体～1.0×107CFU/载体，肠炎沙门菌的回收菌量为1.0×105CFU/载体～1.0×106CFU/载体。6中和剂鉴定试验6.1试验原则通过中和剂鉴定试验结果，判断所选中和方法对消毒剂是否有效中和。若中和Ⅰ组显示可有效中和，则仅使用中和剂培养液进行中和。若中和Ⅰ组结果显示未完全中和，而中和Ⅱ组为有效中和，则在选用中和剂培养液进行中和的基础上，再使用培养液进行二次中和。如仍显示未完全中和，则继续进行中和Ⅱ组试验。试验重复三次。6.2菌悬液的稀释ＷS/T798—202246.2.1取1mL制备好的菌悬液加入9mL磷酸盐缓冲溶液中进行10倍梯度稀释，取4个稀释梯度（举例：10-4、10-5、10-6和10-7）进行中和试验。6.2.2同时取4个稀释梯度各1.0mL采用倾注法接种于TSA平板中，置36℃±1℃恒温培养箱中培养48h±2h后，进行菌落计数。6.3中和Ⅰ组6.3.1试验中所用消毒剂的浓度应以杀菌试验中使用的最高浓度为准。6.3.2选取4个无菌载体加入10mL消毒剂溶液中，