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书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜０１７７—２０１１代替ＳＮ０１７７—１９９２出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌计数方法犕犲狋犺狅犱犳狅狉犲狀狌犿犲狉犪狋犻狅狀狅犳犮犾狅狊狋狉犻犱犻狌犿狆犲狉犳狉犻狀犵犲狀狊犻狀犳狅狅犱犳狅狉犲狓狆狅狉狋２０１１０９０９发布２０１２０４０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ０１７７—１９９２《出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌检验方法》。本标准与ＳＮ０１７７—１９９２相比，主要技术变化如下：———变更为推荐性标准；———检测方法部分参考了ＩＳＯ７９３７：２００４《食品和动物饲料微生物 产气荚膜梭状芽孢杆菌计数 菌落计数技术》内容，在标准中增加乳糖亚硫酸盐试验作为确证试验，减除了含卵黄的ＴＳＣ琼脂和ＰＹ培养基的使用；———补充了商品化的全自动微生物鉴定仪。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：顾鸣、韩伟、谢小珏、王赢、陈立。Ⅰ犛犖／犜０１７７—２０１１出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌计数方法１ 范围本标准规定了出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌（犆犾狅狊狋狉犻犱犻狌犿狆犲狉犳狉犻狀犵犲狀狊）的计数检验方法。本标准适用于出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌的检验。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法ＳＮ／Ｔ１５３８．１ 培养基制备指南 第１部分：实验室培养基制备质量保证通则ＳＮ／Ｔ１５３８．２ 培养基制备指南 第２部分：培养基性能测试实用指南３ 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１产气荚膜梭状芽孢杆菌 犮犾狅狊狋狉犻犱犻狌犿狆犲狉犳狉犻狀犵犲狀狊在特定的选择性培养基上，细菌菌落生长呈现黑色特点（亚硫酸盐降解为硫化物而形成黑色沉淀物，并使菌落呈现黑色），分解乳糖产酸产气，４８ｈ内能液化明胶的细菌。４ 设备和材料４．１ 无菌吸管：１．０ｍＬ和１０．０ｍＬ，分刻度分别为０．１ｍＬ和１．０ｍＬ。４．２ 无菌培养皿：直径９０ｍｍ。４．３ 均质器及均质袋（或均质杯）。４．４ 恒温培养箱或厌氧培养箱：３７℃±０．５℃。４．５ 恒温水浴锅：４６℃±０．５℃。４．６ 厌氧发生装置。４．７ 放大镜和（或）菌落计数器。４．８ 光学显微镜１０×～１００×。４．９ 冰箱：２℃～８℃。４．１０ 天平：感量０．１ｇ。４．１１ 全自动微生物鉴定系统ＶＩＴＥＫｃｏｍｐａｃｔ１）。１） 由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。１犛犖／犜０１７７—２０１１５ 培养基和试剂除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的分析实验室用水。５．１ 亚硫酸盐环丝氨酸琼脂（ＳＣ）：见Ａ．１。５．２ 液体硫乙醇酸盐培养基：见Ａ．２。５．３ 乳糖亚硫酸盐培养基（ＬＳ）：见Ａ．３。５．４ 缓冲动力硝酸盐培养基：见Ａ．４。５．５ 亚硝酸盐检测试剂：见Ａ．５。５．６ 锌粉。５．７ 乳糖明胶培养基：见Ａ．６。５．８ 蛋白胨水：见Ａ．７。５．９ ＶＩＴＥＫ２ＡＮＩ生化鉴定卡２）。６ 检验程序产气荚膜梭状芽孢杆菌检验程序见图１。图１ 产气荚膜梭状芽孢杆菌的检验程序２） 由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。２犛犖／犜０１７７—２０１１７ 操作步骤７．１ 样品的稀释７．１．１ 无菌操作称取检样２５ｇ（ｍＬ）放入无菌均质器或均质袋中，加入２２５ｍＬ蛋白胨水，均质，制成１∶１０样品匀液。７．１．２ 吸取１∶１０样品匀液１ｍＬ，加入到９ｍＬ蛋白胨水中，混合均匀，制成１∶１００样品匀液。必要时，按此法将样品作进一步的１０倍递增稀释。７．２ 接种与培养７．２．１ 选择２个～３个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），每个稀释度分别吸取１ｍＬ样品匀液加入到两个无菌平皿内。７．２．２ 将１０ｍＬ～１５ｍＬ维持在４４℃～４７℃的ＳＣ琼脂倾注平皿，转动平皿使其混合均匀。待培养基凝固后，再覆盖上１０ｍＬＳＣ琼脂，待其完全凝固。７．２．３ 翻转平板，放入厌氧罐或其他适宜容器中，厌氧环境下３７℃±０．５℃下培养２０ｈ±２ｈ。培养时间过长可能会导致平板颜色过黑。７．３ 平板计数７．３．１ 选取菌落数＜１５０ＣＦＵ的平板，计数每个平板上的黑色菌落数，记录稀释倍数。７．３．２ 每个平板挑取５个典型或可疑菌落（小于５个时应全部挑选）进行确证。７．４ 乳糖亚硫酸盐试验确证７．４．１ 接种将ＳＣ琼脂上的典型或可疑菌落接种到液体硫乙醇酸盐培养基中，厌氧环境下３７℃±０．５℃下培养１８ｈ～２４ｈ。以无菌吸管移取硫乙醇酸盐培养物５滴加入到乳糖亚硫酸盐（ＬＳ）培养基中。４６℃水浴中需氧条件下培养１８ｈ～２４ｈ。７．４．２ 观察观察倒管内有否气泡产生及试管底部是否变黑（亚硫酸铁沉淀），若倒管中四分之一以上充满气体并且有黑色沉淀物则可判定为阳性。当倒管中产生的气体不足四分之一时，立即以无菌吸管从先前的ＬＳ培养基中吸取５滴加到另一ＬＳ培养基试管中，４６℃水浴培养１８ｈ～２４ｈ，再次观察结果。７．４．３ 判读在ＳＣ培养基中形成黑色菌落，同时ＬＳ培养基中反应阳性的细菌，可确认为产气荚膜梭状芽孢杆菌，除此之外应视为阴性。７．５ 动力硝酸盐试验和乳糖明胶液化试验确证７．５．１ 纯化将ＳＣ琼脂上的典型或可疑菌落接种到液体硫乙醇酸盐培养基中，厌氧条件下３７℃±０．５℃培养１８ｈ～２４ｈ，划线接种ＳＣ琼脂平板，再覆盖上１０ｍＬＳＣ琼脂。待其完全凝固后，厌氧条件下３７℃±０．５℃培养１８ｈ～２４ｈ，获得纯培养菌落。如有必要，可重复上述步骤，以获得完全分离的，典型的黑色菌落。３犛犖／犜０１７７—２０１１７．５．２ 接种将挑取的纯菌落分别穿刺接种缓冲动力硝酸盐培养基和乳糖明胶培养基，厌氧条件下３７℃±０．５℃培养２４ｈ。７．５．３ 动力硝酸盐试验观察在透射光下检查缓冲动力硝酸盐培养基试管中细菌沿穿刺线生长情况，有动力的菌株沿着穿刺线呈扩散生长；没有动力的菌株，仅沿穿刺线生长。分别加０．５ｍＬ试剂甲与０．２ｍＬ试剂乙于缓冲动力硝酸盐培养基中以检查亚硝酸盐的存在。出现橙红色者，表明有菌株将硝酸盐还原成了亚硝酸盐。若１５ｍｉｎ内未出现颜色变化，则添加少许金属锌粉，放置１０ｍｉｎ。如果加锌粉后出现橙红色，表明菌株不能还原硝酸盐。若出现微弱的亚硝酸盐反应（如：浅粉色）则应排除，因为产气荚膜梭状芽孢杆菌的反应比较剧烈而且迅猛。７．５．４ 乳糖明胶试验观察发现产气和培养基变黄色，表明乳糖发酵并产酸。将试管置５℃冷却１ｈ，检查明胶液化情况。若培养基仍为固态，则需３７℃±０．５℃再培养２４ｈ，再次检查明胶是否液化。７．５．５ 判读在ＳＣ琼脂上形成黑色菌落，无动力的，通常会将硝酸盐还原为亚硝酸盐，分解乳糖产酸产气，４８ｈ内能液化明胶的细菌，确认为产气荚膜梭状芽孢杆菌。７．６ 自动微生物鉴定系统确证如选择ＶＩＴＥＫｃｏｍｐａｃｔ，可从ＳＣ平板上挑选可疑菌落，用生理盐水制成浊度适当的菌悬液，使用ＶＩＴＥＫｃｏｍｐａｃｔ全自动微生物鉴定系统进行鉴定。７．７ 判定任何符合７．４．３或者７．５．５的判读确证或者经７．６的鉴定为产气荚膜梭状芽孢杆菌的菌落，确认为产气荚膜梭状芽孢杆菌。８ 结果报告样品中产气荚膜梭状芽孢杆菌的计数，基于被证实为产气荚膜梭状芽孢杆菌菌落的百分数。例如：１０－４稀释的平板中，平均有８５个菌落，由２个平板上选取的１０个菌落中，有８个被证实为产气荚膜梭菌，那么每克食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌数，即为８５×（８／１０）×１００００＝６８００００ＣＦＵ。根据计算结果报告检样中产气荚膜梭状芽孢杆菌数／ｇ（ｍＬ）。４犛犖／犜０１７７—２０１１附 录 犃（规范性附录）培养基和试剂３）犃．１ 亚硫酸盐环丝氨酸（犛犆）琼脂犃．１．１ 基础培养基胰蛋白 １５．０ｇ酵母膏５．０ｇ大豆胨５．０ｇ焦亚硫酸钠（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）１．０ｇ柠檬酸铁铵１．０ｇ琼脂９．０ｇ～１８．０ｇ犃．１．２ 犇环丝氨酸溶液溶解４ｇＤ环丝氨酸于１００ｍＬ水中，过滤除菌。存放于３℃±２℃，４周内用完。犃．１．３ 制备将基础培养基各成分加热溶解在１０００ｍＬ水中，调节ｐＨ使灭菌后室温下ｐＨ７．６±０．２，分装到适宜容量的烧瓶中，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。倒平皿前，将１００ｍＬ基础培养基冷却到４４℃～４７℃，加过滤除菌的Ｄ环丝氨酸溶液１ｍＬ。当ＳＣ琼脂培养基平板被用来作纯化菌落时（动力硝酸盐试验和乳糖明胶试验）时，可直接取１５ｍＬ冷却到４４℃～４７℃的基础培养基倾注平板。存放于５℃±３℃，可保存２星期。犃．２ 硫乙醇酸盐液体培养基胰酪胨１５．０ｇＬ胱氨酸０．５ｇＤ葡萄糖５．５ｇ酵母膏５．０ｇ氯化钠２．５ｇ硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸）０．５ｇ刃天青０．００１ｇ琼脂０．５ｇ～２．０ｇ将各成分加热溶解在１０００ｍＬ水中，调节ｐＨ使灭菌后室温下ｐＨ７．１±０．２，将培养基分装适宜的试管内，每管１０ｍＬ，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。在使用前，此培养基中应加热煮沸１ｍｉｎ减氧。３） 为保证培养基的质量，应按ＳＮ／Ｔ１５３８．１、ＳＮ／Ｔ１５３８．２的规定进行培养基的制备与性能测试。５犛犖／犜０１７７—２０１１犃．３ 乳糖亚硫酸盐培养基（犔犛）犃．３．１ 基础培养基胰酪胨１５．０ｇ酵母膏２．５ｇ氯化钠２．５ｇ乳糖１０．０ｇＬ半胱氨酸盐酸盐０．３ｇ犃．３．２ 焦亚硫酸钠溶液将１．２ｇ无水焦亚硫酸钠（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）溶解在１００ｍＬ水中，过滤除菌，当天使用。犃．３．３ 柠檬酸铁铵溶液将１．０ｇ柠檬酸铁铵溶解在１００ｍＬ水中，过滤除菌，当天使用。犃．３．４ 制备将基础培养基各成分溶解在１０００ｍＬ水中（如有必要可加热），调节ｐＨ使灭菌后室温下ｐＨ７．１±０．２，分装至装有倒置小导管的试管中，每管８ｍＬ，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。若非配制当天使用，则在临甩前需加热煮沸１ｍｉｎ减氧。存放于３℃±２℃，４周内用完。临用时每管添加０．５ｍＬ焦亚硫酸钠溶液和０．５ｍＬ柠檬酸铁铵溶液，当天使用。犃．４ 缓冲动力硝酸盐培养基胰酪胨５．０ｇ牛肉膏３．０ｇ半乳糖５．０ｇ甘油５．０ｇ硝酸钾（ＫＮＯ３）５．０ｇ磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４）２．５ｇ琼脂１．５ｇ～５．０ｇ将各成分加热溶解在１０００ｍＬ水中，调节ｐＨ使灭菌后室温下ｐＨ７．３±０．２，分装到适宜的试管内，每管１０ｍＬ，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。若非配制当天使用，存放于５℃±３℃。临用前，沸水浴或者蒸汽加热１５ｍｉｎ，迅速冷却至培养温度。配制后４周内用完。犃．５ 亚硝酸盐试剂犃．５．１ 试剂甲在１０００ｍＬ５ｍｏｌ／Ｌ乙酸中溶解对氨基苯磺酸８ｇ；通过滤纸过滤；存放在密封性良好的有塞棕色瓶（最好备有滴头），温度保持在５℃±３℃。犃．５．２ 试剂乙在１０００ｍＬ５ｍｏｌ／Ｌ乙酸中溶解α苯酚５ｇ。通过滤纸过滤；存放在密封性良好的有塞棕色瓶（最６犛犖／犜０１７７—２０１１好备有滴头），温度保持在５℃±３℃。犃．６ 乳糖明胶培养基胰酪胨１５．０ｇ酵母膏１０．０ｇ乳糖１０．０ｇ磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４）５．０ｇ酚红０．０５ｇ明胶１２０．０ｇ将各成分加热溶解在１０００ｍＬ水中，调节ｐＨ使灭菌后室温下ｐＨ７．５±０．２，加入乳糖和酚红。分装到适宜的试管内，每管１０ｍＬ。１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。若非配制当天使用，存放于５℃±３℃。临用前，沸水浴或者蒸汽加热１５ｍｉｎ，迅速冷却培养温度。配制后３周内用完。犃．７ 蛋白胨水在１０００ｍＬ水中溶解蛋白胨１．０ｇ，调节ｐＨ使灭菌后室温下ｐＨ７．０