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ICS65.020.20CCSB16中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5551—2022夜来香花叶病毒检疫鉴定方法DetectionandidentificationofTelosmamosaicvirus2022-07-07发布2023-02-01实施中华人民共和国海关总署发布学兔兔—2022*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(100023)编辑部:(010)65194242-7530网址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张1字数29千字2023年1月第一版2023年1月第一次印刷印数1—500*书号:155175·918定价18.00元学兔兔—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国福州海关、福州市金山公园管理处、福建省农业科学院果树研究所、福建农林大学、中国检验检疫科学研究院。本文件主要起草人:沈建国、刘向国、范婷婷、陈筱铁、谢丽雪、李韬、陈细红、高芳銮、李敏、张永江。ⅠSN/T5551—2022学兔兔范围本文件规定了夜来香花叶病毒的血清学和分子生物学检测方法。本文件适用于进出境植物及其产品中夜来香花叶病毒的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4夜来香花叶病毒基本信息中文名:夜来香花叶病毒学名:Telosmamosaicvirus,缩写:TeMV。分类地位:马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、马铃薯Y病毒属(Potyvirus)成员。夜来香花叶病毒的寄主范围、病害症状、分布地区、传播途径、粒体形态、基因组等其他信息参见附录A。5原理根据TeMV与抗体间的特异性反应,对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)和免疫层析试纸条检测;根据TeMV的基因组特征,对样品进行检测;通过这些方法的有效组合,判定样品是否携带TeMV。6仪器设备、用具及试剂6.1仪器设备高速冷冻离心机、电子天平、酶标仪、PCR仪、荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、-20℃低温冰箱、-80℃超低温冰箱、凝胶成像分析系统、pH计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台等。1SN/T5551—2022学兔兔用具各种量程的可调移液器(1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL、2μL)、PCR反应管、离心管(1.5mL)、研钵等。6.3试剂除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定。DAS-ELISA试剂按照附录B执行、免疫层析试纸条试剂按照附录C执行、RT-PCR试剂按照附录D执行、实时荧光RT-PCR试剂按照附录E执行。7抽样和样品制备7.1抽样有病毒危害症状的植物材料单独抽样,TeMV的危害症状描述参见附录A;无危害症状的植物材料抽样方法按照SN/T2122中的规定执行。7.2样品制备分别按照有症状和无症状进行样品制备。有症状植株每株单独编号并采集症状部位制样;无症状植株,5株为一组编号并混合制样。称取0.5g~1.0g待测样品按1∶10(质量∶体积)加入抽提缓冲液,用研钵研磨成浆,4℃下10000g离心10min,上清即为样品提取液,用于DAS-ELISA和免疫层析试纸条检测;或称取0.1g待测样品提取核酸后用于RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测。8检测与鉴定8.1DAS-ELISADAS-ELISA具体方法按照附录B执行。8.2免疫层析试纸条免疫层析试纸条具体方法按照附录C执行。8.3RT-PCRRT-PCR具体方法按照附录D执行。8.4实时荧光RT-PCR实时荧光RT-PCR具体方法按照附录E执行。8.5序列测定与比对PCR产物纯化后,进行克隆、测序,或者直接测序。利用NCBI网站上的BLAST软件把测序所得到的核苷酸序列与已知的TeMV相应序列进行比对。2SN/T5551—2022学兔兔结果判定样品检测时,检测结果判定按下述原则进行。———若样品经DAS-ELISA或免疫层析试纸条检测结果为阴性,且RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测结果为阴性,则判定样品不携带TeMV。———若样品经DAS-ELISA或免疫层析试纸条检测结果为阳性,且RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测结果为阳性,则判定样品携带TeMV,否则判定样品不携带TeMV。———若样品RT-PCR检测结果为阳性,且实时荧光RT-PCR检测结果为阳性,则判定样品携带TeMV,否则判定样品不携带TeMV。———若样品RT-PCR检测结果为阳性,且序列测定结果经比对分析为TeMV,则判定样品携带TeMV,否则判定样品不携带TeMV。9.2结果记录记录包括样品来源、样品种类、检测时间、检测地点、检测方法和结果、检测人员签字。DAS-ELISA检测结果应有酶联反应数值;免疫层析试纸条检测结果应有试纸条检测图片;RT-PCR检测结果应有电泳图片;实时荧光RT-PCR检测结果应有实时荧光结果图片。10样品的保存经检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在-20℃或-80℃冰箱中1年,并作好登记和标记工作,以备复验、谈判和仲裁。保存期满后,应经灭活处理。3SN/T5551—2022学兔兔(资料性)夜来香花叶病毒的背景资料A.1寄主范围已报道的自然寄主主要为西番莲(Passifloraedulis)、夜来香(Telosmacordata)、广藿香(Pog-ostemoncablin)等植物。A.2病害症状侵染西番莲后能引起一系列症状,包括叶片花叶、扭曲和果实斑驳、变小等。图A.1TeMV侵染西番莲引起的症状(谢丽雪拍摄)A.3分布地区泰国、越南和中国(海南、福建、贵州、广西)。A.4传播途径通过汁液摩擦接种传播。远距离通过带毒种苗传播。A.5粒体形态病毒粒体呈弯曲线状,长约750nm,宽约12nm。4SN/T5551—2022学兔兔病毒粒体(李韬拍摄)A.6病毒基因组正义单链RNA病毒,基因组全序列约9689个核苷酸。5SN/T5551—2022学兔兔(规范性)双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)B.1试剂B.1.1包被抗体特异性的夜来香花叶病毒抗体。B.1.2酶标抗体碱性磷酸酯酶标记的夜来香花叶病毒抗体。B.1.3底物对硝基苯磷酸二钠(pNPP)。B.1.41×PBST缓冲液(pH7.4)氯化钠(NaCl)8.0g磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.15g氯化钾(KCl)0.2g吐温-200.5mL溶于900mL灭菌双蒸水中,并定容至1000mL,4℃储存。B.1.5样品抽提缓冲液(pH7.4)亚硫酸钠(Na2SO3)1.3g聚乙烯基吡咯烷酮(PVP,MW24000~40000)20.0g溶于900mL的1×PBST中,并用1×PBST定容至1000mL,4℃储存。B.1.6包被缓冲液(pH9.6)碳酸钠(Na2CO3)1.59g碳酸氢钠(NaHCO3)2.93g溶于900mL灭菌双蒸水中,并定容至1000mL,4℃储存。B.1.7酶标抗体稀释缓冲液(pH7.4)牛血清白蛋白(BSA)2.0g聚乙烯基吡咯烷酮(PVP,MW24000~40000)20.0g溶于900mL1×PBST中,并用1×PBST定容至1000mL,4℃储存。B.1.8底物缓冲液(pH9.8)二乙醇胺97.0mL氯化镁(MgCl2)0.1g6SN/T5551—2022学兔兔灭菌双蒸水中,用浓盐酸(HCl)调pH至9.8,定容至1000mL,4℃储存。B.2程序B.2.1包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释,加入酶联板的孔中,100μL/孔,加盖,37℃孵育2h或4℃冰箱孵育过夜,倒去酶联板孔中溶液,按每孔100μL的量用PBST洗涤4次~6次,每次1min。B.2.2加样加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照、空白对照,并且至少一个重复,100μL/孔,加盖,37℃孵育2h或4℃冰箱孵育过夜,倒去酶联板孔中溶液,按每孔100μL的量用PBST洗涤4次~6次,每次1min。阴性对照为健康的植物组织(其种类和材料应尽量与检测样品一致),阳性对照为感染TeMV的植物组织,空白对照为样品抽提缓冲液。B.2.3加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度,加入酶联板的孔中,100μL/孔,加盖,37℃孵育2h,倒去酶联板孔中溶液,按每孔100μL的量用PBST洗涤4次~6次,每次1min。B.2.4加底物将底物pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用),加入酶联板的孔中,100μL/孔,室温避光孵育。B.2.5测定光密度在不同的时间如30min、60min或更长时间,阳性对照孔明显显色后,酶标仪在405nm处测定光密度(OD值)。B.3结果判断在满足阴性对照孔的OD405值0.15、阳性对照孔的OD405值/阴性对照孔的OD405值5~10,孔的重复性基本一致的质量要求后,样品OD405值/阴性对照OD405值2,判为阳性。样品OD405值/阴性对照OD405值在阈值附近,判为可疑样品,需重新做一次,或用其他方法加以验证。样品OD405值/阴性对照OD405值2,判为阴性。7SN/T5551—2022学兔兔(规范性)免疫层析试纸条检测C.1试剂样品抽提缓冲液配制方法按照B.1.5执行。C.2程序C.2.1样品准备待测样品按7.2步骤制备,取300μL至1.5mL的离心管中。C.2.2样品检测检测前将试纸条恢复至室温。将试纸条T线一端垂直插入到样品液中,样品液高度不要超过试纸条上的MAX线。测试观察的时间以3min~6min为宜。注:若病毒浓度较低,样品测试观察的时间可适当延长至10min。C.3结果判定结果判定如下:———质控C线显红色,测试T线显红色,检测结果为阳性;———质控C线显红色,测试T线未显色,检测结果为阴性;———质控C线和测试T线均未显色,说明试纸条失效,检测结果无效。C.4试纸条是否有效的判断方法试纸条有效的判断方法如下:———用阳性对照进行测试,测试T线显红色,质控C线显红色,说明整个系统工作正常;———用阳性对照进行测试,测试T线显红色,质控C线未显色,说明质控C线的抗体失效;———用阳性对照进行测试,测试T线未显色,质控C线显红色,说明测试T线的特异性抗体失效;———用阳性对照进行测试,若测试T线未显色,质控C线也未显色,说明整个试纸条失效。8SN/T5551—2022学兔兔(规范性)RT-PCR检测D.1试剂D.1.1TrizoL裂解液D.1.25×TBE缓冲液Tris碱54.0g硼酸(H3BO3)27.5g0.5mol/LEDTA(pH8.0)20.0mL补充蒸馏水至1000mL。用时加蒸馏水稀释至0.5×TBE。D.1.36×