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上海市临床科研基本实验技能培训——哺乳动物细胞培养：基础交流Meetingdate:2009/12/18SpeechmakerYouzhiHuang（PhD）E-mail:service@research-bio.com:上海锐赛生物技术有限公司ShanghaiR&SBiotechnologyCo.,Ltd.HightechnologyandserviceEyeingforIntegratedSolutionR&S,yourreliablecooperator!目录一．细胞培养基本概念二．细胞培养基本要求三．细胞培养基本技术四．锐赛细胞相关技术服务Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!一、细胞培养基本概念•细胞培养定义•细胞培养简史•生长类型•细胞形态•传代次数Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!细胞培养定义定义：模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。优点：1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性；2．可控制：各种物理、化学、生物等因素可调控；3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记；4．应用广：不同物种、不同年龄、不同组织、正常或异常（肿瘤）；缺点：人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同；当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了，必然发生变化。Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!细胞培养简史Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!细胞类型按生长方式:贴壁型细胞（Monolayercells）悬浮型细胞（Suspensioncells）绝大多数有机体细胞属贴壁型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。按细胞形态(贴壁细胞）：成纤维型细胞（Fibroblast-likedcells）上皮型细胞（Epithelium-likedcells）其它，不定型Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!成纤维型细胞梭形或不规则三角形中央有卵圆形核胞质向外伸出长短不同的突起中胚层间质起源上皮型细胞扁平不规则多角形细胞中央有圆形核紧密相连单层膜样生长内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等游走型细胞散在生长，一般不连成片细胞质经常伸出伪足或突起活跃的游走或变形运动羊水细胞培养的早期多形细胞型难以确定规律和稳定的形态如神经组织的细胞等细胞形态Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!接触抑制（Contactinhibition）•细胞相互接触时，将停止增长；•细胞停留在细胞周期的G0期；•转化的细胞却可以继续生长导致细胞重叠堆积生长。Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!•体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一定的界限，称为“Hayflick极限”。•传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。•传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代；幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代。细胞传代次数（PassageNumber）Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!原代培养（primaryculture）从动物机体取出的进行培养的细胞群。生长缓慢，繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。克隆（clone）亦称无性繁殖系或无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。细胞系（cellline）从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖细胞株（cellstrain）从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。原代培养与细胞系•TheAmericanTypeCultureCollection(ATCC)•TheEuropeanCollectionofAnimalCellCulture(ECACC)•NationalInstituteofHealth(NIH),USA•NationalCancerInstitute(NCI),USA细胞系资源Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!二、细胞培养基本要求•常用仪器设备•培养器皿•培养基•血清•其他细胞培养试剂Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!常用仪器设备•超净台或生物安全柜：细胞操作•CO2培养箱：细胞培养•液氮罐：细胞长期冻存•37℃水浴：培养溶液预热，细胞复苏•倒置显微镜：观察细胞•离心机：收集细胞，细胞常用300g转速5min•冰箱：细胞培养溶液分装储存•负压吸引器：细胞培养废液吸取Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!超净台或生物安全柜垂直风超净台水平风超净台生物安全柜Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!CultureflaskCulturePlate培养器皿Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!细胞培养基•干粉培养基和液体培养基–干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制–液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便•常用的培养基种类–RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、McCoys5A、M199、F12等Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!培养基的选择没有一定的标准，有几点建议可供参考：1.建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。2.其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。3.用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!血清使用注意事项1.血清必须贮存于–20～-70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将40～45ml分装于无菌50ml离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10%，必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。2.血清解冻步骤(逐步解冻法):-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。3.热灭活（heat-inactivation）是指56℃,30分钟加热已完全解冻之血清。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement)去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。4.勿将血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!•凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin)造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀物，可用离心3000rpm,5min去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为会阻塞过滤膜。•显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“，但在37℃环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。血清沉淀物Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!谷氨酰胺•谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4℃下放置7天即可分解约50%，所以都是在使用前添加•配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内•使用终浓度为1-4mM•一般配制为100倍浓缩液，即浓度为200mM（29.22g/L）•配制方法为：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mM的溶液，充分搅拌溶解后（应加温30℃），过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入0.5-2ml谷氨酰胺浓缩液，终浓度为1-4mMHightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!酚红•大多数培养液中使用酚红作为pH指示–红色表示中性pH–黄色代表酸性pH–紫色表示碱性pH•在一些特殊培养液中不含酚红–因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!细胞消化液分离组织和分散细胞常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液，单独或混合使用胰蛋白酶溶液•主要作用