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1实验一植物核酸提取一、植物叶片总DNA的大量提取【实验原理】CTAB法原理CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(0.7mol/LNaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后，加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNA充分溶解在液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。【实验目的】利用CTAB法从植物叶片组织中提取高质量DNA。【主要试剂】1.CTAB提取缓冲液：1.4MNaCl，100mMTrispH8.0，2%CTAB，20mMEDTA，0.5%NaHSO3，2%β-巯基乙醇。室温保存，五年有效。2.氯仿：室温保存，五年有效。3.无水乙醇：-20℃保存，五年有效。4.70%乙醇溶液：将无水乙醇和H2O按7:3混合。室温保存，五年有效。5.TE缓冲液（250ml）：2.5ml1MTris-HCl，pH8.0（10mM）；0.5ml0.5MEDTA，pH8.0（1mM）；加H2O至250ml。室温保存，五年有效。【操作步骤】21.在液氮中将叶片研磨粉碎，取1-4克样品于合适的离心管中（初始样品为1克，用13ml管；初始样品1克，用50ml管）。2.每1克样品加入5mlCTAB提取缓冲液和25-50ugRNaseA（可选），颠倒混匀，60-70℃水浴孵育40-50min，期间混匀2-3次。3.从水浴中取出样品，冷却至室温。可选：20-25℃，3000g离心3min，转移上清液到新管中。4.每1克样品加入5ml氯仿。颠倒混匀2-3min。5.20-25℃，10300g离心8-10min，转移上清液到新管中。6.加入等体积氯仿，重复步骤4和5。可选：步骤4和5可重复多次，直到获得澄清的上清液。7.加入等体积的无水乙醇，轻缓颠倒混匀，直到沉淀出现。8.沉淀DNA。方法1：钩出DNA。（1）用接种环钩出DNA（可选：1000g离心1min，富集DNA）。（2）将DNA（可将多个样品的DNA合并成一管）加入70%乙醇溶液中。初始样品为1ml，加入装有1-1.5ml70%乙醇的1.5ml离心管；初始样品1ml，加入装有10-12ml70%乙醇的50ml离心管。（3）20-25℃，13000rpm（1.5ml管）或5100g（50ml管）离心5-7min，弃上清。可选：用上述相同体积的70%乙醇重复洗涤DNA沉淀1次。可选：接步骤（3），以相同速度离心1-2min，用吸头吸尽乙醇。方法2：离心沉淀DNA。（1）20-25℃，5100g离心5-7min，弃上清。（2）加入5-6ml（13ml管）或10-12ml（50ml管）70%乙醇溶液洗涤DNA沉淀，20-25℃，5100g离心5-7min，弃上清。可选：重复步骤（2）1次。可选：接步骤（2），以相同速度离心1-2min，用吸头吸尽乙醇。9.干燥DNA。真空干燥≤10min，空气干燥≤1h（30min左右），DNA过度干燥会导致难以溶解。10.每1ml样品加入100-250ulTE缓冲液溶解DNA。也可适当增加TE缓冲液3用量，或将DNA溶液置于70℃孵育1-4h，促进DNA溶解。相同样品可合并。可4℃过夜溶解。11.DNA溶解完全后，将溶液转入1.5ml离心管。测定DNA浓度后，根据需要，将DNA溶液分装（每管分装1个酶切体系所需DNA量，10ug/管），保存于4℃、-20℃或-80℃冰箱。DNA样品应有唯一性编号，并与原始样品相对应。12.跑0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度，ND1000分光光度计测量DNA浓度。OD230/OD2600.4～0.5说明有盐残留OD260/OD280=1.7～1.9说明纯度很好OD260/OD2801.7说明有有蛋白质污染OD260/OD2802.0说明有有RNA污染【注意事项】1.研磨前，研钵、离心管、药勺等物品均需用液氮预冷彻底，研磨过程应保证样品不融化，研磨应足够细。2.提取过程中，应采用颠倒混匀方式，而不能涡旋混匀，所有过程保证离心管盖盖好，防止液体漏出。3.CTAB缓冲液裂解温度一般为65℃，孵育结束后，应彻底冷却至室温，该步骤可持续1-2h。4.加入氯仿后，应彻底混匀2-3min。5.钩出DNA时，动作要轻缓，洗涤后要除尽乙醇。6.TE缓冲液适用于基因组DNA、质粒DNA长期保存，ddH2O适用于短期保存。DNA溶解后，轻缓晃动离心管，若溶液中有气泡，表明DNA浓度过高，需再加入适量TE缓冲液。7.测定DNA溶液浓度前，应用吸头混匀溶液。8.ND1000分光光度计测量DNA浓度，重复两次。若样品DNA浓度为2-100ng/ul，两次重复差值≤±2ng/ul；若样品DNA浓度100ng/ul，两次重复差值≤2%。4【参考电泳图片】完整度好时电泳带型：单一无拖尾，点样孔无残留杂质如下图：提取效果不好如下图：蛋白残留拖尾降解RNA残留5二、植物叶片总RNA的大量提取【实验原理】植物细胞内的RNA主要是rRNA（占80～85％）、tRNA及小分子RNA（占10～15％）和mRNA（占1～5％）。rRNA含量最丰富，由25S、18S和5S几类组成。mRNA种类繁多，分子量从数百至数千碱基不等，但绝大多数mRNA在3’端都有一个polyA尾巴，因此，可根据此特性用寡聚脱氧胸苷(Oligo-dT)层析柱从总RNA中将mRNA分离出来。一般情况下，提取的总RNA也可用于Northernblot试验。已有多种较为成熟的分离总RNA的方法，常用的有3种。（1）苯酚法：用SDS变性蛋白并抑制RNase活性，经多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAC和乙醇沉淀RNA；（2）盐酸胍法：用异硫氰酸胍或盐酸胍和β-巯基乙醇变性蛋白，并抑制RNase的活性，经酚氯仿抽提后再沉淀；（3）氯化锂沉淀法：因为锂在在一定pH下能使RNA相对特异地沉淀，但容易使小分子RNA损失，而且残留的锂离子对mRNA有抑制作用。采用Trizol试剂盒提取总RNA，其原理是依据盐酸胍法。Trizol法适用于动物、植物和微生物组织，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern分析，Poly（A）分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆等。异硫氢酸胍：有效地RNAse抑制剂。既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离，又对RNA酶有强烈的变性作用。β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除；NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少RNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。酸酚使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与核酸联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而核酸溶于水相。使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚（酚易溶于氯仿中）。6【实验目的】从植物叶片组织中提取高质量RNA。【主要试剂】1、4MGT溶液：4MGT异硫氢酸胍（Guanidinethiocyanate），25mM柠檬酸钠（Sodiumcitrate），0.5%(w/v)十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)，高压灭菌之后，加入巯基乙醇到0.1M（体积比大约为：1.0%）2、2MNaAC（ph值4.9-5.2）3、3MNaAC4、4MLiCL5、DEPCH2O{v/v0.1%DEPC处理的ddH2O（37℃处理12h以上，处理过程要不断搅拌，高温高压灭菌去除残留）}或TE。【操作步骤】1.植物组织1g，液氮研磨；2.倒入50ml离心管中（管中事先放3ml的4MGT，冰浴），震荡混匀；3.加入0.3ml2M的NaAC，震荡混匀；4.加入3ml酸酚（水饱和酚＋抗氧化剂0.1%(w/v)δ-羟基喹啉δ-Hydroxyquinoline），震荡混匀；5.加入1ml氯仿，震荡混匀，6000rpm，13min，取上清；6.加入2倍体积的乙醇，-20度过夜（几小时也可以，产量可能会低）；6000rpm，离心10min，弃上清，留沉淀；7.加入1ml4M的LiCL（放1.5ml离心管中）；13000rpm，10-15min，留沉淀；8.加入0.4mlDEPC处理的水，溶解；9.加入1/2体积的酸酚和1/2的氯仿，震荡混匀；10.13000rpm，离心5min，取上清液；11.加入1倍体积的氯仿；13000rpm，离心5min，取上清液；12.加入0.1倍体积的3MNaAC和2倍体积乙醇；震荡混匀，-20度过夜；713.13000rpm，离心5min，留沉淀；14.沉淀RNA晾干，DEPC水或TE溶解（40—60ul）。注：RNA溶解时不要晾太干，会导致难以溶解。【RNA甲醛电泳】1、试剂配制5X甲醛凝胶电泳缓冲液：0.1mol/LMOPS（pH—7.0）40mmol/L乙酸钠5mmol/LEDTA（pH—8.0）注：将20.6gMOPS溶于800ml经用DEPC处理的50mmol/L乙酸钠溶液（用DEPC处理）用氢氧化钠将溶液的ph值调至7.0，加入10ml经用DEPC处理的0.5mmol/LEDTA（pH—8.0）再加经用DEPC处理的水至溶液总体积为1L。高压灭菌，室温保存于棕色瓶子中（光照或高压灭菌后溶液逐渐变黄，淡黄色的缓冲液可正常使用，而深黄色缓冲液则不然）。甲醛凝胶加样缓冲液：50%甘油1mmol/LEDTA（pH—8.0）0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF2、电泳方法注：所有用于配制与RNA接触的溶液的水需预先经DEPC处理。凝胶制备RNA甲醛变性凝胶浓度通常为1—1.5%。现配制1.2%凝胶28ml：（1）称取0.21g琼脂糖，17.5mlDEPC水，微波炉熔化；（2）冷却至50—60℃，加入37%甲醛5.0ml，5X甲醛电泳缓冲液5.5ml，EB2ul（用于转膜可以不加），混匀；（3）倒胶，室温放置30min以上，使胶彻底凝固；（4）RNA变性体系RNA4.5ul5X甲醛凝胶电泳缓冲液2.0ul甲醛3.5ul8甲酰胺10.0ul混匀，65℃15分钟，迅速冰浴5分钟，稍离心。加入甲醛凝胶加样缓冲液2ul。（5）电泳过程A.先将凝胶放入1X甲醛凝胶电泳液中100V预电泳5—30分钟；B.点样，100V电泳45—60分钟；C.照相。D.纯度（OD260/OD280）：紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数，确保OD260值在0.1~1.0之间，通常离心柱法稀释10倍左右；溶液裂解法稀释40－50倍）OD260/OD2801.9～2.1说明有DNA污染；OD260/OD280=1.9～2.1说明纯度很好；OD260/OD2801.9～2.1说明有部分降解；浓度：用ND1000分光光度计测量，重复两次。【注意事项】1.所有药品都应用DEPC水来配制。所需要的离心管、枪头等都需要用1%的DEPC水处理过夜，然后高压灭菌。2.做试验的非塑料器皿用具需要160-180℃烘干4-8小时。3.做试验的桌面要用1N/L的HCl擦拭，后再用70%乙醇擦拭晾干。4.提取过程尽量带手套和口罩。5.DEPC水的配置：须在通风厨里带手套操作。【参考电泳图片】9Marker（天根MarkerIII）：200，500，80