流式细胞仪培训

流式细胞仪原理与应用陈玉婵提要流式细胞仪简介流式细胞仪工作原理流式实验流程流式细胞术的应用流式细胞术的发展史1930s~1950s:开始出现自动细胞分析技术（细胞的计数，是通过光电仪记录流过一根毛细管的细胞,用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白，应用分层鞘流原理，成功的设计红细胞光学自动计数器。）1960s晚期发展：荧光检测细胞计、细胞分选器检测细胞的荧光信号、单克隆抗体技术1973年，BD公司与美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪FACSI。什么是流式细胞仪？在流动的状态中检测细胞各种物理及生物特征的一种仪器仪器特点：单个细胞通过狭窄激光束，产生能够反映细胞大小的信号，激光束激发不同的荧光素所标记的细胞成分能发射出不同的荧光。InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid流式细胞仪的检测对象藻类细胞染色体血细胞原生动物细胞任何存在于悬液中的直径为0.2-50微米的粒子或细胞都适用于流式分析流式细胞仪工作原理示意图流式的基本组成：1.流动室和液流系统2.光路系统3.电系统流式细胞仪可提供的信息物理信息：通过散射光信号反映相对细胞大小相对细胞颗粒密度和内部复杂度荧光信息：通过荧光强度反映散射光信号的产生488nm激光产生散射光1.散射光信号前向角散射光（FSC,ForwardScatter）入射激光的同向散射光信号反映细胞相对大小及其表面积侧向角散射光（SSC,SideScatter）入射激光90角的散射光信号反映细胞粒度及细胞内相对复杂性散射光散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异通常使用“散点图”来看散射光信号散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据利用散射光信号对混合细胞分群2.荧光信号荧光素与特异抗体结合荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强荧光信号的表示方法双参数点图单参数直方图一个完整流式实验的组成样品的处理调整仪器条件数据处理1.样品处理单细胞悬液的制备浓度51051106/mL外周血、骨髓、培养细胞、组织(经尼龙网300目过滤)制成单细胞悬液选择合适的荧光染料染色必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内荧光素光谱的重叠应当尽量减少2.仪器条件的确定电压阈值荧光补偿（多色分析）处在液流中的粒子通过激光束时产生光信号，这些光信号通过光电探测器转换成电信号（电压）。调整电压，可使信号强度改变。BD流式细胞仪有两种类型的光电探测器：光电二极管和光电倍增管（PMTs）。PMT用于检测较弱的SSC信号和荧光信号，光电二极管用于检测较强的FSC信号电压阈值阈值：信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将不需要的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。荧光补偿采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差荧光补偿补偿调整的实验过程样本准备：阴性样本，单阳性样本调整：第一步：阴性样本调整所有PMT第二步：单阳性样本调整补偿判断标准：补偿模型PE-X%FITC补偿前补偿后FITC单染数据分析设门设定阴性与阳性群体的界限确定阳性与阴性细胞群体统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对数或抗体结合数设门设门的意义：选定要分析的目标细胞设门如何设定阴性与阳性的界限流式检测结果的表示方法百分率绝对计数平均荧光强度图形：直方图、散点图流式细胞仪可以告诉我们什么？流式细胞术的细胞学应用细胞结构细胞大小细胞流式细胞术的细胞学应用粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量染色体分析细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体细胞凋亡流式细胞仪在微生物研究中的应用DNA蛋白过氧化物生成胞内pH鉴别死/活细菌和酵母菌并计数区分革兰氏阳/阴性细菌研究酵母菌细胞器基因表达-绿色荧光蛋白病原菌与吞噬细胞的关系-吞噬引起的呼吸爆发病毒-细胞相互作用：病毒感染导致细胞蛋白表达的改变，对细胞周期的干扰，对细胞内钙离子水平的影响病毒引起的凋亡流式细胞仪的临床应用HIV免疫分型，CD4绝对计数白血病和淋巴瘤的免疫分型肿瘤的细胞周期和倍体分析网织红细胞计数细胞移植的交叉配型和免疫状态监测干细胞计数残量白血病细胞检查HLA-B27检查血小板功能及相关疾病补偿调整实验藻类细胞绝对计数细胞周期分析DNA含量分析-PI染色细胞凋亡细胞膜分析-PS外翻PS（磷脂酰丝氨酸）正常暴露在胞膜的内表面，凋亡时，PS外翻向细胞外表面。重组蛋白Annexin-V可与PS结合细胞凋亡细胞生理学研究Ca2+流动性检测Ca2+是非常重要的细胞内离子，在胞膜到胞浆的信号转导中起重要的作用。细胞受到刺激后，胞内Ca2+浓度会发生改变。最常用的染料Indo-1excitedatUVFluo-3excitedat488nmFuraredexcitedat488nm细胞生理学研究细胞活性分析FluoresceinDiacetate进入活细胞后,被胞内酯酶降解,生成荧光底物.活细胞会发绿色荧光细胞生理学研究细胞膜电位的改变超极化的细胞摄取更多的染料，细胞总的荧光强度增大；细胞去极化时，染料释放到细胞外，总的荧光强度减少。染料和试剂DiOC6(3)DiOC5(3)DiOC1(3)DiOC1(5)ValinomycinGramicidinDCCCP细胞内标记胞内多种肽类已被成功标记，包括病毒颗粒、免疫球蛋白、雌激素受体、细胞因子、特殊蛋白如Bcl-2和cyclooxygenase.胞内细胞因子磷酸化蛋白